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丝素蛋白对蛋白类生物制剂的稳定研究

2020-12-02 898 上传者：管理员

摘要：丝素蛋白是一种高分子量两亲性蛋白质，材料力学性能优异，具有良好的生物相容性以及可控的降解性能，丝素蛋白独特的纳微米结构层可以提高蛋白类药物的稳定性。另外，全水溶性的加工过程，使其具有良好的可塑性。并且制备过程中无需高温和活泼的有机溶剂的引入，这对于蛋白多肽类生物制剂的活性保存具有重要意义，为丝素蛋白在蛋白类生物制剂的稳定和控释方面提供了可能。

关键词：
丝素蛋白
材料力学
生物制剂
生物技术
蛋白类生物制剂
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随着生物技术产业的兴起，已开发出多种形式的肽，蛋白质，抗体，酶，工程融合蛋白和结合物形式的生物制药产品，用于治疗糖尿病，炎症和代谢性疾病以及各种癌症和神经系统疾病[1]。与传统的小分子药物相比，蛋白质治疗剂的优势包括更高的活性，较低的毒性和靶向效应以及可预测的作用机制[2]。往往疗效显著、不良反应小、安全性高，这些有利的性质使蛋白质治疗剂能够实现更高的临床试验成功率[3]。尽管这些生物制剂在临床上有很多优势，但是这些生物制剂存在稳定性差、易被酶解、生物半衰期短等问题，故在存储，制剂和给药方面存在着一些问题，阻碍其在更广泛的在药物释放领域的应用。

对于许多生物制剂而言，其活性取决于精确的结构折叠和/或辅因子分子的特定排列。在生物制剂保存，封装或控释期间容易丧失功能活性。因此保持生物制剂的活性就显得尤为重要。为了对蛋白类生物制剂实现较好的活性保存，我们需要对蛋白质生物制剂的稳定性影响因素以及常用的活性稳定机理具有一个清晰的认识。接下来我们对生物制剂的稳定性机理，丝素蛋白对生物制剂的稳定性机理和丝素蛋白本身的性质三方面进行综述。

1、生物制剂稳定性

在生产，储存和给药过程中维持蛋白质的稳定性至关重要，而生物学活性的测定也是该评估的关键组成部分。蛋白质稳定性的方面可分为物理稳定性和化学稳定两大类。

1.1物理稳定性

生物制剂物理不稳定会导致各种问题：变性，表面吸附，自缔合，沉淀和聚集[4]。通常认为，蛋白质物理稳定性涉及两个关键因素，即结构和构象稳定性以及溶液能量。蛋白质天然结构是各种弱和相反作用力的结果。蛋白质的构象稳定性由氨基酸序列，溶液变量（例如pH和离子强度）以及与配体的相互作用共同决定。蛋白质物理稳定性的第二个主要因素是溶液能量，通常称为“胶体稳定性”。溶液能量学是对蛋白质-蛋白质，蛋白质-表面和蛋白质-溶剂相互作用的描述。物理不稳定性溶液条件直接影响蛋白质的结构稳定性和溶液能量[5]。

1.2化学稳定性

多个氨基酸残基可能会发生化学修饰或破坏[6]。化学修饰与蛋白质功能改变和物理稳定性降低有关。脱酰胺和氧化是最常见的。脱酰胺作用是一种主要发生在天冬酰胺残基上的非酶促反应。天门冬酰胺的脱酰胺修饰了侧链以产生天冬氨酸和异天冬氨酸，并且损失了氨。氧化是共价修饰，最常影响蛋氨酸残基，但所有带有芳族或含硫侧链的残基均易受影响。必须针对该蛋白质量身定制针对特定蛋白质确定的化学不稳定性的缓解策略。主要的缓解策略是确定使降解速率最小化的溶液条件（pH，缓冲液种类，离子强度，赋形剂）。

2、丝素蛋白作为生物稳定材料的机理

生物制剂在丝素蛋白中的稳定机理根据材料的状态可分为液态稳定机制和固态稳定机制。

2.1液态稳定机制

生物制剂的液态稳定性主要与生物制剂的结构和表面化学性质有关。为此，我们回顾了优先排除假说和疏水假说。静电结合假说液态中最广泛接受的蛋白质稳定机制之一涉及通过优先相互作用对蛋白质天然结构进行热力学稳定[7]。简要地，发现长期以来被用作稳定剂的助溶剂优选地从蛋白质表面排除。也可以通过屏蔽疏水域，稳定天然状态并减轻不需要的蛋白质与蛋白质之间的相互作用来改善物理稳定性。

2.2固态稳定机制

生物制剂在固态稳定机制主要分为水置换假设和玻璃动力学假说。水置换假设即干燥过程中水和蛋白质之间失去的氢键被稳定材料和蛋白质之间的氢键所替代[8]。另一种相互竞争的假说，即玻璃动力学假说或玻璃化假说，表明除去水会阻碍降解反应动力学。通过将蛋白质稀释成无定形的刚性玻璃态固体，分子的流动性受到限制，从而阻碍了不稳定性途径。

3、丝素蛋白的组成和结构

丝素蛋白含有18种氨基酸。其主要结构包括重链（～350kDa），轻链（～26kDa）和P25蛋白（～25kDa）。丝素蛋白的分子量和分散性可以由脱胶时间进行调控。此外，理化参数（包括剪切，pH，浓度，盐和加工时间）的变化均会对丝素蛋白的稳定性和溶解性产生影响。

丝素蛋白的二级结构形式主要分为以下四种：无规则卷曲、α-螺旋、β-折叠、以及β-转角[9]。相较于其它的材料而言，丝素蛋白材料中β折叠的含量可控并且直接影响材料的结构和降解性。诱导β折叠最常见方法是用有机溶剂（甲醇、乙醇、甘油、PEG等）处理[10]。此外，高温[11]、接近SF等电点的pH（约4）、使用盐和剪切力、超声[12]处理也会增加其β-折叠含量。高的β折叠含量会赋予丝素蛋白较高的稳定性，力学性能以及较低高的脆性。除此之外，丝素蛋白具有很好的可塑性，可以制备成支架，膜，球等载体形式，可以通过合理的设计达到具有一定空间分布的丝素载体材料。

丝素蛋白材料作为药物载体，其降解速度直接影响药物的治疗效果和安全性。材料的降解是由丝素蛋白材料本身的相互作用力而形成的特定空间构象所决定的，通过水解蛋白酶可以使丝素材料逐步降解。丝素蛋白具有良好的生物相容性，在经过人体的消化吸收后可以产生人体所必需的氨基酸，并且不会产生不良的影响。

4、丝素蛋白在蛋白生物制剂释放上的应用

4.1丝素蛋白对蛋白生物制剂的稳定性研究

由于丝素蛋白材料良好的生物相容性，良好的机械性能，并且在非常温和的水溶条件下进行加工，无高温及活泼有机溶剂的引入，这对于封装或包埋敏感生物制剂（例如治疗性蛋白质和多肽）意义重大。最后，丝素独特的纳微米结构层可以提高活性药物的稳定性。这使得丝素蛋白在生物制剂的保存、运输系统中具有很大的吸引力。

DemuraM等将固定在风干丝膜中的GOx在4℃下于pH7的磷酸盐缓冲液中浸泡4个月后，保留了90%以上的相对活性[13]。与游离酶相比，将GOx固定在丝素蛋白中在高温下可提高活性，但与固定在明胶膜中的酶相比则可提高稳定性，丝素蛋白膜在高温下更稳定[14]。

Yu-QingZhang等制备了装载L-天冬酰胺酶的丝素纳米颗粒（50-120nm），该颗粒具有很高的酶活性，并显示出相似的酶动力学，例如在干燥条件下可在90℃的高温下抵抗30min，并且具有较高的回收率（90%），在血清中有更好的稳定性以及在溶液中的储存稳定性，在药物递送系统中具有很大潜力[15]。

QiangLiu等为了改善乳液中球状蛋白滴的低稳定性，改善药物封装效率，并且提高其在药物释放中的应用。采用微流控流装置来合成辣根过氧化物酶（HRP）加载的丝素蛋白微滴，均匀地生产了油包水型丝素蛋白微滴。经过6周的温浴后，微滴中包封的HRP的稳定性比HRP高25%。因此，微流聚焦以一种分散的微滴形式用于稳定蛋白质，是一种非常有前途的技术[16]。

4.2丝素蛋白对蛋白生物试剂控释的应用

丝素蛋白已被证明对于蛋白制剂的活性具有一定的保护作用。故可作为蛋白类生物制剂的载体。而蛋白类生物制剂的释放机制主要分为扩散、溶胀和降解这三种。丝素蛋白的二级结构和性能可控，导致了可控的降解速度以及可控制的药物释放速率。这使得丝素蛋白在生物制剂的药物输送系统中具有很大的吸引力。

Wang等将辣根过氧化物酶（HRP）和牛血清白蛋白（RhBSA）作为模型蛋白药物被包裹在含有和不含有丝素蛋白涂层的PLGA和藻酸盐微球中。与未涂覆的微球对照相比，该丝素涂层显着延迟了药物释放。PLGA和藻酸盐微球上的丝素涂层提供了机械稳定的外壳以及对包封的蛋白药物的扩散屏障。用丝素蛋白包被微球可以改善生物相容性。除了用于药物递送的包衣以外，包衣还有益于酶改善稳定性和选择性[17]。

QiangLu等研究了丝膜中辣根过氧化物酶（HRP）的稳定和释放。通过在缓和的水性条件下制备水不溶性丝膜，通过对丝素膜的二级结构进行调控，以实现更高的HRP捕获，从而实现对HRP活性的稳定效果。并且通过对丝素颗粒二级结构的调控，得到了不同β折叠的丝素膜，并且通过降解溶解实验发现丝素膜的降解溶解和HRP的释放呈线性关系，这为HRP的稳定和特定释放创造了条件[18]。

5、展望

近年来，生物技术和蛋白质工程学的进步使大量蛋白质和肽的生产成为重要的治疗剂。许多研究人员已使用生物相容性功能聚合物来制备蛋白质和多肽的口服剂，以供长期使用并易于给药以增强患者的依从性。丝素蛋白作为一种天然高分子材料，具有良好的生物相容性和可控的降解速度。并且大量研究证明丝素蛋白对于蛋白类药物具有稳定作用。使丝素蛋白成为蛋白质等敏感性药物稳定和控释的首选载体材料。然而，丝素蛋白对蛋白类药物的稳定和控释仅停留在实验室层面。如何将丝素蛋白应用于蛋白类生物制剂的释放体系中成为当今研究的热点和难点。

参考文献：

[1]吴丽亚,李新贵,邵惠丽,等.再生丝素蛋白结晶及生物应用[J].丝绸,2005(4):50-54.

[10]于同隐,邵亚中.桑蚕丝素蛋白的结构,形态及其化学改性[J].高分子通报,1990(3):154-160.

荣义星.丝素蛋白材料对生物制剂的稳定[J].轻工科技,2020,36(12):60-61+74.