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猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法的建立和应用

2024-01-09 12 上传者：管理员

摘要：目的：建立一种猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法。方法：选择云南省大理地区患有猪支原体肺炎疾病的60只猪作为研究对象，针对猪肺炎支原体的保守序列p36基因设计了引物和探针，建立猪支原体肺炎RT-PCR检测反应体系，并对其灵敏度、特异性、重复性进行分析及临床样本验证。结果：RT-PCR检测灵敏度为102拷贝、与PRRSV、PPV、FMDV、PCV、CSFV、APP等无交叉反应，批内和批间变异系数均小于2.00%，肺组织样本检出阳性数26例(86.67%)，鼻拭子样本检出阳性数19例(63.33%)。结论：该研究成功建立了一种猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法，具有较高的检测灵敏度和特异性，重复性能良好，这为后期MPS的临床精准诊断和疫病科学防控提供试验依据。

关键词：
RT-PCR
灵敏度
特异性
猪支原体肺炎
猪肺炎支原体
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猪支原体肺炎（MPS）是一种由猪肺炎支原体感染引起的接触性、消耗性、慢性呼吸道传染类疾病，临床症状主要表现为气喘、咳嗽、生长迟缓等特点，故也称为猪哮喘病[1]。该病多发于14～20周龄的育肥猪，流行范围广，病程长，治愈率低下，发病率和死亡率长期居高不下，是影响猪养殖业发展的主要疫病之一，严重制约着猪养殖业经济效益[2,3]。因此，正确诊断该病至关重要。临床上常用的MPS诊断方法有酶联免疫吸附试验、血凝试验、免疫荧光试验及补体结合试验等[4]。随着现代分子生物学诊断技术的迅速发展，实时荧光定量PCR(RT-PCR）是近年应用最广泛的一种分子生物学方法，具有灵敏度高、特异性强、准确度高等优势，深受临床兽医工作者的青睐[5]。本研究拟选择云南省大理地区患有猪支原体肺炎疾病的60只猪作为研究对象，应用RT-PCR方法检测该病原体，建立一种猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法，并对其灵敏度、特异性、重复性进行分析及临床样本验证，以期为MPS的临床精准诊断和疫病科学防控提供试验依据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌

猪肺炎支原体（Mhp）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪圆环病毒（PCV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）等病原菌株及临床样品，均置于-40℃条件下，保存于本实验室中。

1.1.2 主要试剂

R N A/D N A病毒基因组提取试剂盒（O M E G A公司）、质粒提取试剂盒（OMEGA公司）、胶回收试剂盒（OMEGA公司）、实时荧光定量检测试剂盒（BIO-RAD）、pMD18-T克隆载体（TAKARA公司），其余各种未说明试剂均为国产分析纯，分别购自上海生工生物工程有限公司和国药集团。

1.2 方法

1.2.1 引物和探针设计

根据N C B I库中查询的M h p的保守序列p 3 6基因进行引物和探针的设计，上游引物为M p-F 1:5’-AGCCTAGCTACCGATTGGCT-3’，下游引物为Mp-R1:5’-CTGGGTAACTGACTTTGCAA-3’，探针为Mp-1:5’-FAM-AGTCCTAATCGAGTGTT ACGTGCTATCACCG-BHQ-3’，该引物和探针的合成均由上海生工生物工程有限公司负责完成。

1.2.2 RT-PCR反应体系的建立

合成p36基因目标片段，通过常规分子生物学方法克隆到pMD18-T载体中，转化感受态细菌后，选择阳性单克隆菌株进行扩大培养，提取质粒，定量后作为本试验的阳性对照。提取病原体基因组DNA作为样本模板，以灭菌双蒸水作为阴性对照。RT-PCR反应体系：5×反应试剂盒溶液5μL,Mp-F1 2μL,Mp-R1 2μL,Mp-1 0.5μL，模板2μL，添加无核酸酶超纯水补齐至25μL。RT-PCR反应参数：42℃反应30 min;95℃反应2 min;95℃反应45 s,48℃反应35 s,72℃反应45 s，共32个循环；72℃继续反应5 min。观察和比较分析检测荧光曲线情况。

1.2.3 RT-PCR检测猪支原体肺炎的灵敏度试验

将构建的阳性对照标准品测定浓度后，分别进行10倍比稀释，依次稀释为108、107、106、105、104、103、102、10、1拷贝，按照建立的反应体系进行RT-PCR检测，比较和分析其检测灵敏度情况。

1.2.4 RT-PCR检测猪支原体肺炎的特异性试验

选取MhP、PRRSV、PPV、FMDV、PCV、CSFV、APP等病原菌，提取基因组DNA，然后分别作为样本模板，按照建立的RT-PCR反应体系进行检测，判断该方法对其他临床常见疫病的病原菌是否存在交叉反应，比较和分析其检测特异性情况。

1.2.5 RT-PCR检测猪支原体肺炎的重复性试验

分别选取同一批次的106、105、104拷贝3个浓度梯度的阳性对照标准品作为模板，进行RT-PCR批内检测，每个样本重复3次，分析和比较其批内变异系数（CV值）。分别选取不同批次的106、105、104拷贝3个浓度梯度的阳性对照标准品作为模板，进行RT-PCR批间检测，每个样本分别进行独立3次试验，分析和比较其批间变异系数。以此来验证该方法检测重复性情况。

1.2.6 临床样本验证试验

选择临床患病猪的鼻拭子、肺组织，分别提取基因组DNA，按照建立的RT-PCR反应体系进行检测，比较2种不同采集途径的样本检测结果情况。

2、结果

2.1 灵敏度试验结果

通过以10倍比稀释后的阳性质粒标准品作为样本模板进行RT-PCR检测，按照建立的反应体系进行操作，结果显示本方法可以检测到102拷贝，即最低检出限为102拷贝，具有较高的检测灵敏度。

2.2 特异性试验结果

如图1所示，除Mhp经RT-PCR检测可扩增出明显的荧光曲线外，其余PRRSV、PPV、FMDV、PCV、CSFV、APP病原菌均未扩增出荧光曲线，结果显示本方法检测Mhp时，与其他病原菌没有交叉反应，即具有良好的检测特异性。

图1 RT-PCR检测Mhp的特异性荧光曲线

2.3 重复性试验结果

RT-PCR检测Mhp的批内和批间重复性试验情况，见表1。批内3个不同浓度样本标准品（106、105、104拷贝）变异系数均<1.00%,CV值在0.54%～0.88%。批间3个不同浓度样本标准品（106、105、104拷贝）变异系数均<2.00%,CV值在0.97%～1.48%。结果显示，本方法的批内和批间变异系数均较小，具有良好的检测重复性。

表1 RT-PCR检测Mhp的批内和批间重复性试验情况对比分析

2.4 临床样本验证结果

从表2中数据可见，分别选取肺组织和鼻拭子样本各30份，其中肺组织样本检出阳性数26例，阳性率为86.67%，鼻拭子样本检出阳性数19例，阳性率为63.33%。结果表明，通过提取肺组织基因组DNA进行RT-PCR检测的阳性率高于鼻拭子。

表2 鼻拭子和肺组织基因组DNA的RT-PCR检测结果情况对比分析

3、讨论

猪支原体肺炎是一种由猪肺炎支原体感染导致的猪地方流行性慢性肺炎，属于接触性、消耗性、慢性呼吸道传染类疾病，其病原体最早是在1965年由Switzer和Mare等研究者在猪的肺组织中发现的[1]。该病的主要传染源是病猪和带菌猪，可通过呼吸道分泌物进行扩散传播，最早可发生在2～3周龄的仔猪，6～10周龄的猪感染率和发病率最高。本病的初期临床症状主要是咳嗽和体温上升，随后表现出食欲不振、精神萎靡，不愿站立，流出黏性鼻液，甚至发生呼吸困难和哮喘，最终窒息而死亡[5,6]。因此，本病长期以来一直是危害养猪业的主要流行病之一，造成较大的经济损失。

早期正确的诊断是该病有效防控的前提基础。随着分子生物学技术的不断进步，实时荧光定量PCR是一种在普通PCR反应体系内增加了荧光探针，在扩增过程中，利用荧光信号随着循环数的增加而发生累计现象，实时检测PCR全过程，最终达到对样本中目标DNA片段进行定性或定量分析的目的，现已广泛应用于各种动物疫病的临床检测工作中[7]。宋建领等[8]成功建立了RT-PCR检测猪肺炎支原体的方法，主要是针对猪肺炎支原体黏附素p97基因序列进行引物和探针的设计，建立的反应体系经过优化后，具有较高的灵敏度和特异性。刘博等[1]通过对猪NLRP3基因序列进行引物和探针设计，建立并优化了RT-PCR检测猪支原体肺炎方法，灵敏度达到84拷贝，特异性和重复性能良好。肖婷等[9]和于新友等[10]也分别建立了RT-PCR检测猪肺炎支原体的方法，灵敏度、特异性和重复性也得到了验证，这为后续该病的科学防控提供了检测的技术支持。

本研究选择云南省大理地区患有猪支原体肺炎疾病的60只猪作为研究对象，针对猪肺炎支原体的保守序列p36基因设计了引物和探针，并成功建立了猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法，其灵敏度为102拷贝，与PRRSV、PPV、FMDV、PCV、CSFV、APP等无交叉反应，特异性强，批内和批间变异系数均小于2.00%（批内3个不同浓度的样本标准品变异系数在0.54%～0.88%，批间3个不同浓度的样本标准变异系数在0.97%～1.48%），重复性较好，并在临床样本上得到较好的验证，鼻拭子阳性率为63.33%，肺组织阳性率为86.67%。这与其他一般文献研究报道的结果相一致，具有较好的检测性能[11,12,13]。

本研究通过对我国云南省大理地区的60只支原体肺炎患病猪的研究，成功建立了一种猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法，具有较高的检测灵敏度和特异性，重复性能良好，且临床样本验证阳性率较符合预期结果，这为后期本地区MPS的临床精准诊断和疫病科学防控提供试验依据。

参考文献:

[1]刘博,张倩,莫玲,等.猪NLRP3基因Real-time PCR检测方法的建立及应用[J].动物医学进展,2023,44(9):19-23.

[2]付成民,翟宝库.猪支原体肺炎的流行病学､临床表现和防控措施[J].现代畜牧科技,2020(11):118-119.

[5]张红云,梁晶晶,李回,等.猪肺炎支原体PCR检测方法的建立及初步临床应用[J].广西农业科学,2010,41(3):256-258.

[6]何建军,李雨来.猪支原体肺炎的流行病学､临床表现､诊断和防控措施[J].现代畜牧科技,2021(12):83-84.

[7]李知新,王进香,闫小芹,等.宁夏牛支原体肺炎RT-PCR方法的诊断[J].中国动物检疫,2012,29(1):44-45.

[8]宋建领,高华峰,信爱国,等.猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J].畜牧与兽医,2013,45(5):71-74.

[9]肖婷,何颖,赵硕,等.猪肺炎支原体､猪圆环病毒2型和3型多重荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用[J].动物医学进展,2023,44(2):8-14.

[10]于新友,李天芝,李书光,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪肺炎支原体双重荧光PCR检测方法的建立[J].中国兽医杂志,2023,59(6):60-64.

[11]王彩芬.猪支原体肺炎的流行病学､临床症状及防治[J].猪业科学,2023,40(8):105-106.

[12]耿兵.猪支原体肺炎的流行特点､临床症状和防治措施[J].中国畜禽种业,2022,18(6):136-137.