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血清4型禽腺病毒Fiber-1蛋白截短表达及多克隆抗体制备

2024-04-17 109 上传者：管理员

摘要：目的:制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-1基因截短蛋白多克隆抗体，为FAdV-4病的诊断、检测及致病机制研究奠定基础。方法:对FAdV-4的CH/AHMC/2015分离株Fiber-1基因序列(MG148335.1:30459-31754)进行信号肽、疏水性和抗原决定簇分析，截取具有较高免疫原性的片段，设计合成特异性引物，以CH/AHMC/2015分离株基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得截短Fiber-1(sFiber-1)基因片段，将其连接至原核表达载体pET-32a,验证后转化至大肠杆菌BL21感受态中，诱导表达sFiber-1蛋白。纯化后的蛋白与佐剂乳化后免疫SD大鼠，制备多克隆抗体，并测定多克隆抗体效价。用Western-blot检测抗体免疫原性。结果:成功构建了sFiber-1的原核表达载体，获得FAdV-4的sFiber-1重组蛋白，经SDS-PAGE鉴定，重组sFiber-1蛋白大小约为52 kDa,主要以包涵体形式表达；间接ELISA法测得sFiber-1多克隆抗体效价为1∶213;Western blot结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别出重组sFiber-1蛋白。结论:本研究成功表达了FAdV-4的重组sFiber-1蛋白，制备了具有较高免疫活性的sFiber-1多克隆抗体，可为FAdV-4的检测及诊断奠定基础。

关键词：
Fiber-1基因
多克隆抗体
禽腺病毒
血清4型禽腺病毒
重组蛋白
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禽腺病毒(Fowl adenvirus, FAdV)包括众多血清型[1]。其中，肝炎-心包积液综合征是血清4型禽腺病毒(FAdV-4)感染的主要症状，且其具有高致病性和高传染性的特点，3～10周龄的鸡、鸭、鹅最为易感，死亡率可达10%～80%[2,3]。种禽和产蛋鸡群感染FAdV-4后死亡率一般不超过10%,但可引起产蛋率下降10%～30%[4]。

1987年，FAdV-4感染首次报道于巴基斯坦[4]。随后该病迅速蔓延至美国、印度、南非、加拿大、韩国、新西兰、墨西哥、伊拉克、智利、日本、俄罗斯等国家[5]。2015年之前，我国偶尔有个别FAdV-4病例报道，当时未引起重视，但自2015年6月以来，山东、安徽、河南、广东等省份家禽密集养殖地区呈现FAdV-4暴发性流行的趋势，死亡率达到30%～70%,给我国家禽业造成了巨大的经济损失[6,7,8,9,10]。

目前，对FAdV-4病尚无有效治疗方法，因此研制FAdV-4病的诊断方法对于防控该病具有重要意义。FAdV-4病毒的Fiber-1蛋白位于病毒粒子表面，具有特异性的抗原决定簇，参与病毒增殖、组装、扩散及宿主特性的选择[11,12]。本研究截取Fiber-1蛋白抗原性较好的第114～424氨基酸(sFiber-1)片段进行原核表达，并制备sFiber-1多克隆抗体，为FAdV-4检测方法的建立及其致病机制等的研究奠定基础。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和载体

FAdV-4的CH/AHMC/2015分离株由家禽疫病防控监测安徽省重点实验室保存，pET-32a载体由本实验室保存。

1.1.2 主要菌株及试剂

大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自通用生物(安徽)股份有限公司；BamH I和Hind III、T4 DNA连接酶、胶回收试剂盒、Taq酶、质粒小提试剂盒购自宝日医生物技术(北京)有限公司；预染180 kDa蛋白Marker、考马斯亮蓝染色液、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PEG20000、HRP标记的羊抗鼠IgG均购自北京索莱宝科技有限公司；病毒DNA提取试剂盒购自美国奥美嘉生物技术公司。

1.1.3 试验动物

2只成年雌性SD大鼠，购自白湖博源实验用品公司。

1.2 方法

1.2.1 FAdV-4病毒DNA提取

根据OMEGA E. Z. N. A. Viral DNA Kit说明书，提取FAdV-4安徽分离株CH/AHMC/2015的基因组DNA,置于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 sFiber-1序列选取及PCR扩增引物设计

根据GenBank中收录的CH/AHMC/2015分离株的Fiber-1基因全序列(MG148335.1:30459-31754),利用在线软件SignalP-5.0分析其是否有信号肽；利用TMHMM-2.0预测序列的跨膜区；利用在线分析工具(http: //www.detaibio.com/tools)预测Fiber-1的抗原决定簇。根据生物信息分析结果，截取Fiber-1蛋白抗原性较好的第114～424氨基酸片段，用Primer Premier 5.0设计引物，引物序列为F:

,其中，下划线处为BamH I和Hind III酶切位点，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 序列片段扩增

以安徽分离株CH/AHMC/2015的基因组DNA为模板，扩增sFiber-1序列。PCR反应的退火温度为60 ℃,其余反应条件参考说明书。用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并回收大小与目的片段一致的片段，置于-20 ℃保存。

1.2.4 重组质粒的构建

用BamH Ι和Hind III对pET-32a载体和目的片段进行双酶切，双酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，切取与预期大小一致的片段进行胶回收，用T4 DNA连接酶连接回收的目的片段与线性化pET-32a载体，构建pET-32a-sFiber-1重组质粒，并转化至BL21感受态[13]。阳性克隆经扩大培养后，提取质粒进行双酶切鉴定，验证正确的质粒进一步进行测序验证。

1.2.5 sFiber-1重组蛋白的表达鉴定及纯化

将测序验证过的菌液接入培养基培养，当菌液OD600值达到0.5～0.7时，收集未诱导的菌液后加入IPTG,37 ℃、170 r/min诱导蛋白表达，分别在诱导1.5、3.0、4.5 h后收集菌液，将收集到的菌液离心后留沉淀菌体，加入适量PBS和5×蛋白上样缓冲液煮沸10 min, 进行SDS-PAGE电泳，分析重组蛋白表达情况。以最佳条件诱导1 L菌液，离心后用PBS重悬菌体沉淀，在冰上超声破碎，破碎3 s, 冷却4 s, 每次工作5 min, 超声5～6次后离心，收集上清液和沉淀，沉淀用包涵体溶解液重悬，上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳以确定重组蛋白在菌体中的分布情况[14]。最后依次用6、4、2、0 mol/L尿素对包涵体蛋白进行复性，用PEG20000浓缩复性蛋白后，测定蛋白浓度，保存于-20 ℃备用。

1.2.6 sFiber-1多克隆抗体的制备

免疫前从眼眶后静脉丛采集大鼠血液，分离血清作为阴性血清对照，按1∶1的比例混合乳化弗氏完全佐剂与sFiber-1蛋白(2.3 mg/mL),背部皮下多点免疫SD大鼠，每只免疫500 μg蛋白。在一免后的14、21、28 d加强免疫，加强免疫时将sFiber-1蛋白与弗氏不完全佐剂按1∶1比例充分乳化，每只免疫500 μg蛋白，第4次免疫7 d后对大鼠进行眼眶采血，血液4 ℃静置过夜后离心分离血清，作为sFiber-1多克隆抗体，保存于-70 ℃备用。

1.2.7 抗体效价的测定

ELISA方法测定大鼠抗FAdV-4 sFiber-1蛋白多克隆抗体的效价。用包被液稀释sFiber-1蛋白，包被ELISA板，每孔100 ng, 4 ℃过夜。后续试验的孵育温度均为37 ℃,每次孵育后用PBST洗涤3次。用含5%脱脂奶粉的封闭液进行封闭，每孔200 μL,封闭1 h; 将sFiber-1多克隆抗体按1∶2～1∶218的梯度进行稀释，作为一抗，孵育1 h; 加入HRP标记的山羊抗大鼠IgG(1∶6 000稀释),孵育1 h; 加入底物显色液TMB避光孵育15 min, 用20% H2SO4终止反应，用酶标仪读取OD450值。当某孔的OD450值为后一孔OD450值的2倍及以上时，该孔的稀释倍数则为多克隆抗体的效价[15],同时设置大鼠阴性血清对照试验。

1.2.8 多克隆抗体的Western blot鉴定

将重组sFiber-1蛋白进行SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h后洗涤3次，用sFiber-1多克隆抗体(1∶100)4 ℃孵育过夜；洗涤后，加入HRP标记的山羊抗大鼠IgG(1∶3 000),37 ℃孵育1 h后洗涤3次，最后加入DAB显色液显色，观察结果。

2、结果与分析

2.1 sFiber-1序列扩增及原核表达载体的构建

图1 sFiber-1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果

图2 重组质粒pET-32a-sFiber-1双酶切(BamH Ι和Hind III)鉴定结果

2.2 重组蛋白的表达及可溶性鉴定

使用IPTG诱导含阳性重组表达质粒的菌液，经诱导后菌体能够表达重组sFiber-1蛋白，大小约为52 kDa, 且诱导4.5 h后的菌液表达sFiber-1重组蛋白的效果最佳(图3)。将IPTG诱导后的菌液超声破碎，离心后的沉淀及上清液分别进行SDS-PAGE电泳，如图4所示，重组蛋白sFiber-1主要以包涵体形式表达。

图3 SDS-PAGE分析pET-32a(+)-sFiber-1的时相表达

图4 SDS-PAGE分析pET-32a(+)-sFiber-1的蛋白分布情况

2.3 多克隆抗体的效价测定

以重组蛋白sFiber-1为包被抗原，利用间接ELISA方法测定sFiber-1多克隆抗体效价，结果表明本研究制备的sFiber-1多克隆抗体效价为213。

2.4 多克隆抗体的Western-blot分析

Western blot分析显示，FAdV-4的sFiber-1重组蛋白能够被制备的sFiber-1多克隆抗体识别，条带大小为52 KDa, 与目的条带一致(图5),而阴性血清无法识别sFiber-1重组蛋白。

图5 抗sFiber-1多克隆抗体的Western blot分析

3、结论与讨论

近年来，血清4型禽腺病毒已成为一种危害养禽业发展的重要病毒，其主要危害3～10周龄的禽类，给养禽业造成了巨大的经济损失，但目前仍缺少有效的防治措施，因而进行快速准确的检测和诊断可为该病的防控提供参考[16]。目前该病毒的主要诊断方法有ELISA检测、血清中和试验、分子生物学检测、病毒分离培养等。上述方法中，病毒分离法检测周期相对较长，步骤复杂，对人员要求高，分子生物学检测方法成本相对较高，而ELISA检测方法具有快速、高效、安全便捷、特异性强、灵敏度高等特点，更适用于临床检测[17]。

FAdV-4的衣壳蛋白主要包括Hexon、Penton、Fiber-1和Fiber-2等4个结构蛋白，其中Hexon、Fiber-1和Fiber-2在FAdV-4的感染和致病等方面具有重要的作用，但目前国内外关于FAdV-4的病原检测及抗体的制备主要针对Hexon与Fiber-2蛋白[18,19]。谢泉[20]建立了基于Hexon蛋白的ELISA检测方法，但检出率不高。Pan等[21]用FAdV-4病毒作为包被抗原，建立了一种ELISA方法，但无法特异性检测FAdV-4。

Mase等[22]对FAdV-4的Fiber-1核苷酸序列进行分析，显示Fiber-1的核苷酸序列可区分不同的禽腺病毒血清型。因而，本研究以Fiber-1为目标蛋白，通过在线生物信息分析软件预测Fiber-1蛋白的信号肽、跨膜区和抗原决定簇的分布，截取其具有较好免疫原性的片段进行表达，成功构建了pET-32a-sFiber-1表达载体，获得了重组sFiber-1蛋白，经免疫大鼠制备了多克隆抗体，效价检测表明本研究制备的多克隆抗体效价较高，当稀释213倍后仍能识别抗原。此外，我们进一步通过Western blot分析sFiber-1多克隆抗体的免疫原性，结果显示，sFiber-1多克隆抗体能够特异性的识别重组sFiber-1蛋白，而阴性血清无法识别sFiber-1蛋白，进一步表明本研究制备的sFiber-1多克隆抗体免疫原性较高。

综上，本研究制备了重组sFiber-1蛋白和具有较高免疫活性的多克隆抗体，研究结果可为建立具有较好特异性的血清4型禽腺病毒的ELISA检测方法奠定基础，为血清4型禽腺病毒病的防控提供参考。

参考文献:

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