大肠杆菌和沙门氏菌属于肠杆菌科革兰氏阴性杆状细菌。大肠杆菌是存在于动物和人类肠道的共生菌，某些致病性大肠杆菌菌株被指定为禽致病性大肠杆菌菌株(APEC),会导致家禽发生局部或全身性疾病[1]。家禽中与大肠杆菌相关的疾病有卵黄囊感染、脐炎、呼吸道感染、败血症、多发性糜烂炎、肠炎、蜂窝织炎和输卵管炎等[2]。沙门氏菌病常由禽源沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌3种病原菌感染导致，这些病原菌是导致家禽发生临床疾病和人类食源性疾病的重要病原菌，目前已经鉴定出2 300多种血清型沙门氏菌，其中10%从家禽中分离获得[2]。当养殖环境拥挤或卫生条件差，家禽尤其是幼禽营养不良或受到应激时均会导致其感染致病性沙门氏菌[3]。采取加强生物安全防控、疾病净化、病原菌疫苗免疫、抗生素预防与治疗等措施，可以有效预防控制家禽感染细菌[4]。

幼禽因生长发育尚不完全，抵抗力弱，更易感染大肠杆菌和沙门氏菌，加之抗生素的不合理使用，导致越来越多耐药菌株的出现。为了了解雷州半岛雷州市规模化家禽养殖场腹泻家禽的细菌感染情况，本试验对收集的20余份病料进行病原菌的分离培养、革兰氏染色和镜检、麦康凯和伊红美蓝培养基筛选，对筛选到的病原菌进一步进行生化试验和16S rRNA鉴定确定其种类，最后对病原菌进行药敏试验和动物回归试验，以期为指导雷州半岛雷州市规模化家禽养殖场的临床用药和家禽健康养殖提供理论依据。

1、材料

1.1 病料及菌株

病死及濒临死亡家禽的脾脏、肝脏、心包液等病料20余份，采自雷州半岛雷州市三家规模化家禽养殖场；大肠杆菌标准菌株、沙门氏菌标准菌株，均由广东海洋大学预防兽医实验室保存。

1.2 试验动物

6周龄健康雏鸭15羽，体重为(750±5)g, 由珠海百试通动物实验中心提供。

1.3 主要试剂与仪器

普通琼脂培养基、LB肉汤，均购自北京陆桥技术有限责任公司；水解酪蛋白(MH)培养基、革兰氏染色液试剂盒，均购自广东环凯微生物科技有限公司；三糖铁斜面培养基，购自卡迈舒(上海)生物科技有限公司；麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、细菌基因组DNA提取试剂盒，均购自北京索莱宝科技有限公司；细菌微量生化反应管，四环素、多西环素、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、左氧氟沙星、丁胺卡那、庆大霉素、阿米卡星、新霉素、卡那霉素、大观霉素、氟苯尼考、多黏菌素B、头孢氨苄、头孢噻肟药敏纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司；10×PCR Buffer、dNTP、Taq酶、DL-2 000 Marker等，均购自TaKaRa公司。恒温培养箱，购自上海精宏实验设备有限公司。

2、方法

2.1 病原菌的分离与鉴定

2.1.1 病原菌的分离

无菌采集死亡家禽的肝脏、脾脏和心包液等组织，分别划线接种于普通琼脂培养基中，37 ℃恒温培养18 h; 挑取优势单个菌落进行纯化，对纯化后的单个菌落进行革兰氏染色、镜检，并接种到LB肉汤中培养18 h, 最后于-20 ℃保存菌体。

2.1.2 培养鉴定与生化鉴定

将2.1.1中纯化后的细菌分别接种在麦康凯培养基及伊红美蓝培养基中，37 ℃培养18 h, 观察培养基中菌落的颜色。挑取麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上不同颜色的菌落用LB肉汤培养，然后分别接种于细菌微量生化反应管中，置37 ℃恒温培养箱中培养48 h, 观察结果；同时取LB肉汤培养的菌液穿刺接种于三糖铁斜面培养基中，置37 ℃恒温培养箱中培养24 h, 观察结果。

2.1.3 PCR扩增及电泳鉴定

根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取菌株的基因组DNA,以此为模板，采用16S rRNA通用引物(F 5′-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3′,R 5′-CTTACCGGGCA-ATACACTCACTA -3′)进行PCR扩增。PCR扩增体系(总体积为20 μL):模板0.5 μL,上下游引物各0.5 μL,PCR MasterMix 10 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共30个循环；72 ℃再延伸10 min。取扩增产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定后对目的片段进行切胶回收，胶回收产物送到苏州金唯生物科技有限公司广州公司测序，测序结果与NCBI中收录的序列进行比对分析。

2.1.4 药敏试验

将生化鉴定后的菌株接种到LB肉汤中，37 ℃振荡培养12 h; 用灭菌棉签蘸取细菌悬液均匀涂布在MH培养基上，再将药敏纸片贴在培养基表面，每个培养基均匀贴4个药敏纸片，置37 ℃恒温培养箱中倒置培养18 h, 观察药敏纸片周围是否有抑菌圈，测量抑菌圈直径大小，并按照参考文献[5]判定结果。

2.2 动物回归试验

将15羽健康雏鸭随机均分为大肠杆菌试验组、沙门氏菌试验组和对照组。将本试验获得的大肠杆菌和沙门氏菌分离株接种于LB肉汤中，培养16 h后采用平板法进行活菌计数。将菌液稀释至浓度为1×108 cfu/mL,口服灌喂试验雏鸭，0.5 mL/只，对照组灌喂等体积的生理盐水，观察雏鸭发病情况并统计死亡率，剖检观察并取病死鸭心血、肝脏组织、脾脏组织进行细菌分离鉴定。

3、结果与分析

3.1 菌株的分离与镜检

在普通琼脂培养基上可见大量表面光滑且湿润的单个菌落，呈扁平状隆起，有光泽，直径为1～2 mm, 颜色有乳白色和灰白色两种，见图1。经革兰氏染色后镜检可见革兰氏阴性、两端钝圆、单个或成对存在的短杆状菌，见图2。

3.2 细菌鉴定

3.2.1 培养鉴定

灰白色菌落(A类)经麦康凯培养基培养得到红色菌落，伊红美蓝培养基培养得到带金属光泽的紫黑色菌落，符合大肠杆菌的特征，共得到31份A类菌。乳白色菌落(B类)经麦康凯培养基培养得到无色或琥珀色菌落，伊红美蓝培养基培养得到粉红色菌落，符合沙门氏菌的特征，共得到10份B类菌。分离株鉴定培养结果见图3。

3.2.2 生化鉴定

经三糖铁斜面培养基培养，31份A类菌均能使培养基变为红色，10份B类菌均能使培养基变为黑色。A类菌和B类菌的生化鉴定结果见表1。综合三糖铁斜面培养基的培养结果与生化鉴定结果，初步鉴定A类菌为大肠杆菌，共31株；B类菌为沙门氏菌，共10株。

图1 普通琼脂培养基上的菌落形态   

图2 革兰氏染色结果(100×)   

3.3 16S rRNA PCR扩增

利用16S rRNA通用引物进行 PCR扩增，结果(见图4)在约1 482 bp处有特异性目的条带，与预期结果相符。测序结果经NCBI的BLAST程序搜索比对，鉴定标准按照相似性≥98%判定，确定A类菌与登录号为KY655122.1的大肠杆菌的相似性高达98.3%,B类菌与登录号为CP033356.2的鼠伤寒LT2沙门氏菌亚种的相似性高达98.49%,上述分析表明分离出的病原菌主要为大肠杆菌和沙门氏菌。

图3 分离株培养鉴定结果   

3.4 药敏试验

结果见表2。

由表2可知：31株大肠杆菌对多黏菌素B的敏感率为58.0%,对头孢噻肟的敏感率为100%,对其他药物的耐药率为67.7%～100%;10株沙门氏菌对左氧氟沙星的敏感率为30.0%,对环丙沙星的敏感率为50.0%,对多黏菌素B的敏感率为80.0%,对头孢噻肟的敏感率为100%,对其他药物的耐药率为50.0%～100%。

3.5 动物回归试验

大肠杆菌试验组和沙门氏菌试验组雏鸭在接种本试验分离菌1 d后开始发病，出现精神萎靡、缩颈、站立不稳等现象，有的雏鸭排出黄绿色水样粪便，肛门附近有许多黏糊状物。病理剖检结果显示：沙门氏菌试验组雏鸭肝脏、脾脏肿大，肝脏上有灰白色坏死灶，脾脏上有花斑状坏死点(见图5);大肠杆菌试验组雏鸭呈现腹膜炎症状。细菌分离鉴定结果显示，沙门氏菌和大肠杆菌均为阳性。对照组雏鸭全部正常生长，未见不良反应。

表1 生化鉴定结果

图4 16S rRNA PCR扩增结果   

4、讨论与结论

本试验从雷州半岛雷州市规模化家禽养殖场采集的病死及濒临死亡家禽的病料中分离出31株大肠杆菌和10株沙门氏菌。在实际生产中，家禽发生大肠杆菌和沙门氏菌的混合感染通常是因为家禽养殖场卫生条件差、消毒不规范、养殖密度高导致空气不流通等，混合感染的病例非常常见。陈培培等[6]从青岛市即墨区某鸡场送检的雏鸡病料中分离出大肠杆菌和沙门氏菌，这两种菌具有较强致病力并且严重耐药；高强等[4]从甘肃省某饲养场患病死亡肉仔鸡的肝脏、脾脏、心脏病料中分离出大肠杆菌、白痢沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌；罗翔等[7]从田东县采集的59份腹泻病料中分离出致病性大肠杆菌、沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌，以上研究结果与本试验结果基本一致。

大肠杆菌常见于继发感染，其耐药性比沙门氏菌严重。2011—2018年，吕敏娜等[8]从广东省不同地区养鸽场采集的病料中分离出大肠杆菌，该菌对氨基糖苷类的庆大霉素、卡那霉素和新霉素严重耐药；刘凯迪等[9]从广东省、福建省、浙江省、江苏省和山东省水禽养殖场及周边环境采集的样品中分离出449株大肠杆菌，这些大肠杆菌对氨苄西林、金霉素、氟苯尼考和磺胺类药物的耐药率达到90%左右，对环丙沙星的耐药率为50%,对替加环素和美罗培南则比较敏感。温肖会等[10]调查了广东省珠三角地区禽源大肠杆菌的耐药性，结果有229株大肠杆菌对四环素、复方磺胺甲口恶唑、阿莫西林、氨苄西林、多西环素和链霉素的耐药率较高，在70%～90%之间，对阿米卡星的耐药率最低为8.3%。本试验分离得到的 31株致病性禽源大肠杆菌的耐药情况严重，对四环素类药物、氨基糖苷类药物、喹诺酮类药物、氟喹诺酮类药物、酰胺醇类药物及头孢类药物中的头孢氨苄的耐药率达到67.7%～100%,高度耐药，说明无论是广东省珠三角地区，还是粤西地区的雷州半岛，禽源大肠杆菌的耐药性都非常严重，但对多肽类多黏菌素B的耐药率在29.0%以内，且仅对头孢噻肟敏感。

感染鼠伤寒沙门氏菌的许多家禽病例都表现为纤维素性肝周炎和心包炎[11],其临床剖检情况与本试验送检病料的剖检情况一致。周荣云等[11]从扬州地区的鹅、鸭和鸡肝脏、脾脏、心脏等病料中分离出21株禽源鼠伤寒沙门氏菌，分离株对复方新诺明、链霉素的耐药性很强，所有菌株均对新霉素、丁胺卡那、卡那霉素高度敏感，同时有10株鼠伤寒沙门氏菌出现多重耐药性，3耐及以上菌株的耐药率达到38.09%,5耐、6耐、7耐菌株均只有1株。蔡双双等[12]从湖北省黄陂地区肉鸭养殖场病料中分离出2株鸭源鼠伤寒沙门氏菌，耐药性分析结果显示这2株菌对氯洁霉素、万古霉素、麦迪霉素、氧哌嗪青霉素、苯唑青霉素有耐药性。吕敏娜等[8] 从广东省不同养鸽场采集的病料中分离出沙门氏菌，该菌对四环素类、利福霉素类、大环内酯类(除阿奇霉素外)、林可酰胺类药物的耐药性达到80%以上，对氨基糖苷类、喹诺酮类药物均高度敏感，且对喹诺酮类药物中的氧氟沙星、恩诺沙星的耐药性逐年上升。本试验分离得到的10株沙门氏菌对环丙沙星的敏感率为50.0%,对多黏菌素B的敏感率为90.0%,对头孢噻肟的敏感率为100%,而对其他四环素类药物，氨基糖苷类药物，喹诺酮类药物的多西环素、诺氟沙星、恩诺沙星，酰胺醇类药物的耐药率在67.7%～100%之间，说明分离获得的沙门氏菌的耐药性存在差异。本试验对沙门氏菌的耐药性分析结果与Niu J. L.等[13]从湛江地区鸭场环境中分离到的沙门氏菌耐药性相似，但本试验分离到的沙门氏菌对恩诺沙星和多西环素的耐药率为90.0%,而从鸭场环境中分离到的沙门氏菌对这两种药物还较敏感。2019年，Tang B.等[14]对我国华东地区22个鸡、鸭和猪养殖场沙门氏菌耐药性的调查结果显示，最常见的耐药谱是庆大霉素、大观霉素、头孢噻呋、头孢他啶、氟苯尼考、磺胺呋喃唑、甲氧苄啶、磺胺甲口恶唑、恩诺沙星、氧氟沙星、四环素，进一步证明目前家禽养殖端耐药性问题严重且突出。

表2 药敏试验结果

图5 沙门氏菌试验组病理剖检结果   

目前，关于家禽大肠杆菌和沙门氏菌分离鉴定及抗生素试验的研究报道很多，但耐药程度如此高的现象在我国粤西地区患病家禽中还未曾被研究。自禁抗令发布后，畜禽养殖端开始提倡绿色养殖，在家禽疾病治疗上更是采取了减抗和替抗的方式来治疗和预防疾病。由于畜禽养殖业大肠杆菌和沙门氏菌感染导致的细菌病难以治疗，一旦发病，治疗难度极大，养殖场将遭受巨大的经济损失。针对此种情况，粤西地区的畜牧兽医从业者需要严格执行有关禁抗的法规要求，而本试验结果显示，从雷州半岛雷州市规模化家禽养殖场分离到的大肠杆菌和沙门氏菌对多黏菌素B和头孢噻肟敏感，因此可以使用多黏菌素B和头孢噻肟进行治疗，减少经济损失，并积极研发新的替抗产品，争取摆脱抗生素滥用导致的耐药菌株泛滥情况，做到绿色养殖。

参考文献:

[4]高强,薛瑞林,李守湖,等.鸡源大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定及耐药分析[J].中国兽药杂志,2020,54(11):14-21.

[5]刘玉庆,李璐璐,骆延波,等.EUCAST欧盟药敏试验标准[J].中国标准导报,2016(5):60.

[6]陈培培,齐心,张灿,等.即墨区鸡源大肠杆菌及沙门氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J].黑龙江畜牧兽医,2019(22):76-79,180.

[7]罗翔,黄宝学,曾如笔,等.田东县祥周镇肉鸡腹泻3种细菌病流行病学调查分析[J].云南畜牧兽医,2022(2):13-16.

[8]吕敏娜,孙铭飞,沈浩铎.2011—2018年广东鸽源大肠杆菌､沙门氏菌耐药性分析[J].畜牧兽医科技信息,2019(12):46-48.

[9]刘凯迪,罗华东,王琳琳,等.东南沿海地区水禽源大肠杆菌耐药表型及耐药基因型的调查[J].中国畜牧兽医,2021,48(12):4690-4701.

[10]温肖会,魏文康,丘婷,等.广东省禽源大肠杆菌分离株的耐药性调查[J].安徽农业科学,2018,46(11):74-77,117.

[11]周荣云,李军朝,邸涛,等.21株禽源鼠伤寒沙门氏菌的分离鉴定及耐药性研究[J].黑龙江畜牧兽医,2016(16):131-133.

[12]蔡双双,杨旭,仲晓丽,等.鸭源鼠伤寒沙门氏菌的分离鉴定及致病性观察[J].湖北农业科学,2014,53(2):378-381.

基金资助:广东省科技计划广东省水禽健康养殖重点实验室项目(2017B030301008);广东海洋大学博士启动项目(R17090);广东省教育厅特色创新强校项目(230420055; B18115);

文章来源:温锦芳,周慧,姚秋成等.雷州半岛地区禽源致病性大肠杆菌和沙门氏菌分离鉴定及耐药分析[J].黑龙江畜牧兽医,2024(01):59-64.