重金属铬(Cr)毒性大，在生物体具有富集强的特点。进入动物体后，通过血液循环到达全身，从而对机体产生不同的损害作用。畜禽吸收后将会严重损伤消化道，造成中枢神经系统、肝脏、肾脏等器官的损伤[1]。研究发现六价铬[Cr(Ⅵ)]通过人类肿瘤细胞系以及大鼠肝脏和垂体细胞中的线粒体途径刺激细胞死亡[2]。

《医学启源》记载：“白术除湿益燥，和中益气，温中，去脾胃中湿，除胃热，强脾胃，进饮食，安胎”,具有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎等功效。白术含有挥发油、多糖、黄酮类、氨基酸等活性成分，白术多糖是其主要活性成分之一，具有抗氧化、抗凋亡、免疫调节及保肝等作用，但其在Cr(Ⅵ)毒性中的保护作用及其机制报道较少。因此，通过探究RAMPSt对Cr(Ⅵ)致PK-15细胞氧化损伤和染Cr(Ⅵ)小鼠肾损伤的保护作用，为中药多糖缓解Cr(Ⅵ)所致肾损伤提供参考。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、动物及白术多糖

猪肾上皮细胞(PK-15)由本实验室保存；40只Balb/c小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司；RAMPSt为本实验室提取保存，多糖含量为82%。

1.1.2 主要试剂

牛血清蛋白(BSA)和水溶性复合物(BCA)蛋白质测定试剂盒，北京康维世纪生物科技有限公司产品；蛋白裂解液、二甲基亚砜(DMSO)、十二烷基硫酸钠(SDS)和Tris Base, 北京索莱宝科技有限公司产品；1.5 mol/L Tris (pH8.8)和1.5 mol/L Tris (pH6.8),湖北赛维尔公司产品；PVDF膜，Millpore公司产品；封闭专用脱脂奶粉(D8340)、细胞膜蛋白及细胞浆蛋白抽提试剂盒、SOD、GSH和MDA检测试剂盒、活性氧检测试剂盒、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)检测试剂盒，上海碧云天技术有限公司产品；雅酶彩虹预染蛋白Marker, 上海雅酶生物科技有限公司产品；Bcl-2抗体，武汉三鹰生物技术有限公司产品；Bax抗体，Gene Tax公司产品；小鼠活性氧簇(ROS)ELISA检测试剂盒，上海源桔生物科技有限公司产品；超敏ECL化学发光检测试剂盒、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、小鼠抗GAPDH单克隆抗体Cat: 60004,Proteintech公司产品；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，Dojindo公司产品；CCK-8试剂盒，Med Chem Express公司产品；DMEM培养基，Gibco公司产品；胎牛血清，浙江四季青生物科技有限公司产品；胰蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器

超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；二氧化碳培养箱，北京众力挽生物科技有限公司产品；倒置生物显微镜，上海帝纶；流式细胞仪，Becton Dickinson公司产品；电泳及转膜设备，北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将PK-15细胞培养于含有50 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培养基，在37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度箱中培养。

1.2.2 动物试验

40只6周龄小鼠随机分为对照组、Cr(Ⅵ)处理组(40 μmol/kg)、200 mg/kg RAMPSt组和200 mg/kg RAMPSt+Cr(Ⅵ)组，每组10只。采用灌胃方式连续给药5 d, 每天1次，治疗组给药RAMPSt按照小鼠体重计算(200 mg/kg),对照组以及Cr(Ⅵ)处理组灌胃等量的生理盐水。于第6天剖检并采集肾脏，并放-80℃冰箱保存备用。

1.2.3 CCK-8法检测细胞存活率

参照CCK-8试剂盒说明书测定细胞活力。将PK-15细胞在96孔板中培养。根据试验进行分组，分别添加不同浓度的Cr(Ⅵ)(20、40、60、80、100 μmol)并处理不同的时间(6、12、24 h),以及40 μmol Cr(Ⅵ)和不同浓度的RAMPSt(50、100、200 、400 μg/mL)共处理，每组设置3个平行复孔。加入CCK-8检测液，并用酶标仪在450 nm的波长检测吸光度，评估细胞活力。

1.2.4 流式细胞术检测线粒体膜电位

将PK-15细胞接种于6孔板，置37℃、体积分数为5% CO2培养箱中。试验分为空白对照组、Cr(Ⅵ)处理组、RAMPSt组、RAMPSt+Cr(Ⅵ)组，每组设置3个平行复孔。每组加入0.5 mL JC-1染色液，吹打，混匀，37℃孵育20 min, 用流式细胞仪进行检测。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率

按照1.2.4方法进行细胞的培养及分组，参照Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒说明书分析各组细胞凋亡，即采用预冷的PBS洗涤细胞3次，加入适量的缓存液进行重悬，加入10 μL Annexin V-FITC混匀后，4℃孵育15 min再加入10 μL PI溶液混匀，并采用流式细胞仪进行上机检测。

1.2.6 激光共聚焦显微镜观察凋亡细胞

将PK-15细胞接种于6孔板，置37℃、体积分数为5% CO2培养箱中并进行分组。按照操作进行爬片、洗涤、通透、封闭、孵育一抗并4℃过夜、孵育二抗1 h后并在激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.7 流式细胞术检测ROS

将PK-15接种于6孔板并置37℃、体积分数为5% CO2培养箱中。使用ROS检测试剂盒，利用荧光探针DCFH-DA检测细胞中ROS水平。即1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA,最终浓度为10 μmol/mL,37℃培养孵育20 min。用无血清培养基清洗3次，以充分除去未进入细胞的DCFH-DA。收集细胞，并用1 mL的PBS重悬细胞用于流式细胞仪检测。

1.2.8 MDA和GSH含量与SOD活力的检测

将PK-15细胞置37℃、体积分数为5% CO2培养箱中，待细胞长到70%～80%,采用胰酶法消化细胞后，按照试剂盒说明书的方法测定MDA含量、GSH含量与SOD活力。

1.2.9 ELISA检测ROS含量

将小鼠的肾脏组织在4℃冰浴下用生理盐水制成10%组织匀浆，并取匀浆组织，参照试剂盒说明书的方法检测ROS的含量。

1.2.10 蛋白免疫印迹试验

将PK-15细胞置37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养24 h后，用细胞裂解液于冰上裂解各组细胞，提取细胞蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白样品浓度。并对所提取的蛋白进行蛋白变性，进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，并转至偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后在5%脱脂奶粉下封闭2 h。并用TBST洗涤，每次10 min, 然后放入一抗Bcl-2、Bax、Caspase-3(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)中，4℃过夜孵育；TBST充分洗涤PVDF膜3次，然后放入二抗中，室温孵育60 min, TBST洗膜。然后通过显影仪显像得到的图片用Image J 软件对蛋白灰度值。

1.2.11 统计学分析

每组试验进行3次重复，数据采用平均值±标准差表示，使用SPSS 24.0对数据进行One-Way ANOVA统计分析。用GraphPad Prism 7.0软件作图，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2、结果

2.1 Cr(Ⅵ)的细胞毒性作用

PK-15细胞的活性随着Cr(Ⅵ)的浓度和作用时间的增加而降低(图1)。用Cr(Ⅵ)处理PK-15细胞会引起细胞损伤，呈时间和浓度梯度依赖性关系；在40 μmol Cr(Ⅵ)处理PK-15细胞12 h后，细胞的相对存活率为51.6%,因此选择40 μmol Cr(Ⅵ)处理12 h作为后续的试验条件。

图1 Cr(Ⅵ)对PK-15细胞的毒性作用  

2.2 RAMPSt对PK-15细胞活性的影响

在50～400 μg/mL时，RAMPSt对PK-15细胞没有损伤作用(图2)。与对照组相比，40 μmol Cr(Ⅵ)处理组细胞存活率显著降低(P<0.01),200 μg/mL RAMPSt组细胞存活率较Cr(Ⅵ)处理组显著增高(P<0.01)。因此，选用200 μg/mL RAMPSt作为后续试验浓度。

2.3 RAMPSt对Cr(Ⅵ)诱导细胞内氧化应激的影响

与对照组相比，Cr(Ⅵ)处理组PK-15细胞内ROS水平显著升高(P<0.01),RAMPSt组较Cr(Ⅵ)处理组相比，细胞内ROS水平显著降低(P<0.01)(图3A和3B)。与对照组相比，Cr(Ⅵ)处理组细胞内的MDA水平显著升高(P<0.01),GSH、SOD水平显著降低(P<0.01),而RAMPSt组较Cr(Ⅵ)处理组相比，细胞内的MDA水平显著降低(P<0.01),GSH、SOD水平显著升高(P<0.01)(图3C、图3D和图3E)。

图2 RAMPSt对PK-15细胞活性的影响   

2.4 RAMPSt对Cr(Ⅵ)诱导细胞内线粒体膜电位变化的影响

Cr(Ⅵ)处理组线粒体膜电位下降显著高于对照组(P<0.01)(图4),而RAMPSt干预后线粒体膜电位下降，较Cr(Ⅵ)处理组显著降低(P<0.01)。

2.5 RAMPSt对Cr(Ⅵ)诱导细胞凋亡的影响

Cr(Ⅵ)处理组的细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01),RAMPSt干预后，细胞凋亡率较Cr(Ⅵ)处理组显著降低(P<0.01)(图5)。

2.6 RAMPSt对Cr(Ⅵ)诱导细胞凋亡相关蛋白的影响

与对照组相比，Cr(Ⅵ)处理后Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.01),Bax表达显著升高(P<0.05),RAMPSt组干预后后显著抑制了Cr(Ⅵ)引起的Bcl-2蛋白表达水平的降低(P<0.05)及Bax蛋白表达水平的升高(P<0.01)(图6)。

2.7 氧化应激在Cr(Ⅵ)诱导的细胞凋亡的作用

添加抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)后，可以显著抑制Cr(Ⅵ)诱导PK-15细胞内ROS水平的增加(P<0.01); RAMPSt也可以显著抑制Cr(Ⅵ)诱导PK-15细胞内ROS水平的增加(P<0.01)(图7A和图7B);与对照组相比，Cr(Ⅵ)处理组的荧光强度显著增多(图7C),而NAC+Cr(Ⅵ)组和RAMPSt+Cr(Ⅵ)组与Cr(Ⅵ)处理组相比，荧光强度减少，结果表明ROS参与了Cr(Ⅵ)诱导的细胞凋亡，降低ROS的水平可以缓解Cr(Ⅵ)诱导的PK-15细胞凋亡。

2.8 RAMPSt对Cr(Ⅵ)诱导小鼠肾脏组织氧化应激相关指标的影响

与对照组相比，Cr(Ⅵ)处理后小鼠肾组织中ROS、MDA水平显著升高(P<0.01),GSH、SOD水平显著降低(P<0.01),RAMPSt组干预后抑制了Cr(Ⅵ)引起的ROS、MDA水平的升高和GSH、SOD水平的降低(图8)。

图3 RAMPSt对Cr(Ⅵ)诱导细胞内氧化应激的影响  

图4 RAMPSt对Cr(Ⅵ)诱导的PK-15细胞MMP的影响   

图5 RAMPSt对Cr(Ⅵ)诱导细胞凋亡的影响   

图6 RAMPSt对Cr(Ⅵ)致PKG15细胞BclG2、Bax、蛋白表达的影响   

2.9 RAMPSt对Cr(Ⅵ)诱导小鼠肾脏组织的影响

与对照组相比，Cr(Ⅵ)组小鼠肾组织中抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著降低(P<0.01),促凋亡蛋白Bax表达水平显著升高(P<0.01);而RAMPSt干预后Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.01),Bax蛋白表达水平的降低(P<0.01)(图9)。

3、讨论

Cr(Ⅵ)通过食物链威胁公众健康，肾脏是蓄积和排泄Cr(Ⅵ)的主要器官，通过筛选Cr(Ⅵ)致PK-15细胞损伤的浓度和时间，发现在12 h时Cr(Ⅵ)对PK-15细胞的IC50是40 μmol, 因此选用Cr(Ⅵ)40 μmol和12 h作为本研究的试验浓度和作用时间。根据Cr(Ⅵ)的作用时间选择RAMPSt的最佳作用浓度，最终选用40 μmol/mL 的Cr(Ⅵ)和200 μg/mL 的RAMPSt进行共处理或者单独处理12 h进行试验。

图7 流式细胞术检测ROS与激光共聚焦观察细胞凋亡  

图8 小鼠肾组织中氧化应激指标的变化  

图9 小鼠肾组织中Bcl-2蛋白、Bax蛋白的表达水平   

多糖是中草药中含量最为丰富的活性成分之一，植物多糖在缓解重金属中毒方面效果很好[3]。本试验设计了在PK-15细胞上探究RAMPSt对Cr(Ⅵ)诱导的细胞凋亡的保护作用。肾脏参与渗透调节和毒物的代谢导致组织病理学改变[4],选用小鼠作为动物模型，观察RAMPSt对Cr(Ⅵ)诱导小鼠肾氧化应激及凋亡的作用。

氧化应激是指机体或细胞内ROS与内源性抗氧化防御失衡而引起的组织或细胞损伤状态[5]。本研究证明RAMPSt能够缓解Cr(Ⅵ)诱导的ROS产生，且RAMPSt缓解了Cr(Ⅵ)诱导的脂质过氧化，提高抗氧化酶GSH、SOD的活性。Cr(Ⅵ)处理诱导小鼠氧化应激，表现为过氧化物酶活性显著降低，MDA和SOD显著升高[6]。在小鼠试验上，Cr(Ⅵ)可以引起小鼠肾脏组织中ROS、MDA的含量升高，GSH、SOD活性的降低，说明Cr(Ⅵ)可以引起小鼠肾组织氧化损伤，添加RAMPSt可以缓解小鼠肾组织的氧化损伤。MDA是脂质过氧化的稳定代谢物。MDA是氧化反应的主要副产物，被认为是氧化应激的有效标志物[7]。

线粒体负责许多基本的细胞功能，如新陈代谢、钙(Ca2+)的调节、活性氧的产生和细胞凋亡的启动。线粒体功能障碍是包括癌症在内的许多病症的基础[8]。线粒体膜电位是细胞凋亡的特征性标志，由氧化应激诱导。正常的线粒体膜电位是维持线粒体氧化磷酸化和ATP产生的先决条件。ROS产生的累积负担可导致MMP分解，进而导致能量缺乏和线粒体功能障碍[9]。试验发现，Cr(Ⅵ)单独处理会引起PK-15细胞线粒体膜电位的下降，诱导细胞内线粒体的损伤和功能障碍，而RAMPSt可以缓解线粒体膜电位的下降，表明RAMPSt可以缓解线粒体损伤。细胞死亡过程中激活的许多促炎途径发生在线粒体外膜通透化过程中，这是线粒体凋亡过程中细胞死亡的关键点[10]。流式细胞术检测发现Cr(Ⅵ)可以诱导PK-15发生细胞凋亡，而RAMPSt与Cr(Ⅵ)共处理后，细胞凋亡率下降。在细胞凋亡过程中，BCL-2家族蛋白通过激活BAX和BAK以及阻断抗凋亡BCL-2成员来促进线粒体通透性[11]。蛋白质印迹分析表明，Cr(Ⅵ)诱导了细胞内凋亡相关蛋白Bax蛋白水平升高；Bcl-2蛋白水平降低，而RAMPSt减弱了线粒体凋亡通路信号蛋白的变化。caspase-3是线粒体依赖性细胞凋亡途径中的关键酶和主要执行半胱天冬酶[12]。此外，Cr(Ⅵ)会诱导小鼠肾脏组织中Bax表达水平的升高和Bcl-2表达水平的降低，表明Cr(Ⅵ)诱导了小鼠肾脏细胞的凋亡，而RAMPSt可以抑制Cr(Ⅵ)诱导小鼠肾脏细胞的凋亡。细胞凋亡是细胞死亡的主要模式，受许多促凋亡基因和抗凋亡基因的调节[13]。试验通过抗氧化剂NAC验证了清除ROS对Cr(Ⅵ)诱导的细胞凋亡有缓解作用，RAMPSt有同样的效果。这些结果都表明Cr(Ⅵ)能够引起细胞凋亡及其小鼠肾损伤，而RAMPSt能够通过清除线粒体中过量的ROS来缓解其造成的损伤作用。

综上所述，RAMPSt通过清除过量的ROS,阻断氧化应激介导的线粒体凋亡途径发挥拮抗Cr(Ⅵ)致PK-15细胞和小鼠肾氧化应激及凋亡的作用。RAMPSt是一种天然活性物质，作为Cr(Ⅵ)中毒的解毒剂提供重要的理论依据。

参考文献:

[1]张伊,杨金勇,高慧,等.过量重金属元素对动物生理毒性及作用机制的研究进展[J].饲料研究,2021,44(22):141-144.

[3]朱成香.黄精多糖抗铅-镉复合重金属致肝损伤药效学评价及作用机制研究[D].贵州贵阳:贵州师范大学,2021.

基金资助:山东省自然科学基金项目(ZR2021MC088);

文章来源:吕昌洋,范汝鹏,赵茜曼等.白术多糖对Cr(Ⅵ)诱导PK-15细胞凋亡和小鼠肾损伤的影响[J].动物医学进展,2024,45(03):59-66.