淫羊藿苷为淫羊藿中的多羟基黄酮苷类活性成分，具有显著的抗骨质疏松[1]、抗肿瘤[2]、神经细胞保护、增强机体免疫力[3]等药理作用，广泛应用于食品、保健品、化妆品、中成药等领域[4],但其对照品价格昂贵[5]。朝藿定C、淫羊藿苷母核相同，仅糖链有所差异，并且前者含量较高，对照品价格低廉，但它具有一定毒性[6],并且分离纯化过程复杂，导致资源浪费。

目前，关于淫羊藿中黄酮苷类化合物的酶水解有大量报道，主要是蜗牛酶[7,8,9]、纤维素酶[10,11]、葡萄糖苷酶[12,13,14]等脱去淫羊藿多糖苷C-7位的葡萄糖转化为低糖苷。文献[15]将淫羊藿混合黄酮与A.sp.y39菌液共孵育后得到淫羊藿苷，但其转化率低，分离纯化复杂。李丹凤[16]采用酸对淫羊藿苷进行水解，虽然水解率较高，但反应难以控制，易产生副产物。

以α-L-鼠李糖苷酶将淫羊藿C转化为淫羊藿苷被认为是最特异、有效、环境友好的方法[17]。Lyu[18]、Wu等[19]在工程菌中克隆并表达了不同来源的α-L-鼠李糖苷酶，发现纯化后的重组酶可将朝藿定C定向转化为淫羊藿苷。尹蔓妮[20]报道通过α-L-鼠李糖苷酶水解朝藿定C来制备淫羊藿苷的方法，但并未对工艺进行优化，并且底物质量浓度较低。因此，本实验优化α-L-鼠李糖苷酶水解朝藿定C制备淫羊藿苷工艺，以期为淫羊藿资源综合开发利用及该成分绿色工业化生产提供参考依据。

1、材料

1.1试剂与药物

淫羊藿苷对照品(陕西乐博生化科技有限公司，批号191010,纯度≥98%)。朝藿定C(纯度≥98%,实验室自制)。α-L-鼠李糖苷酶(青岛隆川生物科技有限公司，0.2 U/mg,批号20210213);牛血清白蛋白(陕西乐博生化科技有限公司)。乙腈、甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.2仪器

高效液相色谱仪(型号Agilent 1260 Infinity,美国安捷伦科技公司);核磁共振波谱仪(型号AVANCE-ⅢHD 600 MHz,德国布鲁克公司);质谱仪(型号LTQ-Orbitrap XL,美国Thermo Fisher公司);电热恒温水浴锅(型号DZKW-D-2,北京市永光明医疗仪器有限公司);旋转蒸发仪[型号RV10DS96,艾卡(广州)仪器设备有限公司];电子天平(型号JA500,上海衡平仪器仪表厂);电热鼓风干燥箱(型号101-3A,天津市泰斯特仪器有限公司);数控超声波清洗器(型号KQ-500DE,昆山市超声仪器有限公司)。

2、方法

2.1 HPLC分析条件

Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm）；流动相乙腈-0.1%磷酸（30∶70）；体积流量1 mL/min；柱温30℃；检测波长270 nm；进样量10μL。

2.2对照品溶液制备

精密称取朝藿定C、淫羊藿苷对照品适量，甲醇溶解，制成分别含两者200、100.8μg/mL的溶液，即得。

2.3方法学考察

2.3.1线性关系考察

分别取“2.2”项下对照品溶液2、6、10、14、18μL,在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品进样量为横坐标(X),峰面积纵坐标(Y)进行回归。

2.3.2精密度试验

取“2.2”项下对照品溶液10μL,在“2.1”项色谱条件下进样测定5次，计算朝藿定C、淫羊藿苷峰面积RSD。

2.3.3稳定性试验

取供试品溶液10μL,于0、12、24、36、48 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算朝藿定C、淫羊藿苷含量RSD。

2.3.4加样回收率试验

取各成分含量己知(朝藿定C 2.14 mg/g、淫羊藿苷1.06 mg/g)的淫羊藿约1 g,共6份，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入“2.2”项下对照品溶液、甲醇各10 mL,精密称定质量，在35℃下超声(300 W、40 kHz)处理30 min,冷却至室温，甲醇补足减失的质量，摇匀，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算朝藿定C、淫羊藿苷平均加样回收率、RSD。

2.4单因素试验

2.4.1缓冲液种类

取200μg/mL朝藿定C对照品溶液1 mL,置于具塞试管中，加入20 mg/mL牛血清白蛋白溶液0.1 mL,0.2 mol/L磷酸盐(pH 5)、Tris-HCl(pH 5)、醋酸-醋酸铵(pH 5)、醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5)各0.9 mL,α-L-鼠李糖苷酶0.4 U,50℃水浴反应8 h。

2.4.2 pH值

取200μg/mL朝藿定C对照品溶液1 mL,置于具塞试管中，加入20 mg/mL牛血清白蛋白溶液0.1 mL、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 3.5、4、4.5、5、5.5、6.0)0.9 mL、α-L-鼠李糖苷酶0.4 U,50℃水浴反应8 h。

2.4.3温度

取200μg/mL朝藿定C对照品溶液1 mL,置于具塞试管中，加入20 mg/mL牛血清白蛋白溶液0.1 mL、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 4.5)0.9 mL、α-L-鼠李糖苷酶0.4 U,分别在40、45、50、55、60、65℃下水浴反应8 h。

2.4.4底物与酶用量比例

取200μg/mL朝藿定C对照品溶液1 mL,置于具塞试管中，加入20 mg/mL牛血清白蛋白溶液0.1 mL、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 4.5)0.9 mL、α-L-鼠李糖苷酶，使底物与酶用量比例分别为1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8,50℃水浴反应8 h。

2.4.5反应时间

取200μg/mL朝藿定C对照品溶液1 mL,置于具塞试管中，加入20 mg/mL牛血清白蛋白溶液0.1 mL、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 4.5)0.9 mL、α-L-鼠李糖苷酶0.4 U,50℃水浴分别反应1、8、12、24、48、72、96、120 h。

2.4.6底物质量浓度

按底物与酶用量比例1∶2称取朝藿定C、α-L-鼠李糖苷酶，加入牛血清白蛋白溶液、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 4.5)适量，使朝藿定C含量分别为0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5 mg/mL,50℃水浴反应72 h。

2.5朝藿定C转化率、淫羊藿苷得率测定

“2.4”项下单因素试验结束后，加2 mL甲醇终止反应，混合均匀，经0.22μm有机滤膜过滤，取续滤液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算朝藿定C转化率、淫羊藿苷得率，公式分别为转化率=[(m1-m2)/m1]×100%、得率={(m3/M2)/[(m1-m2)/M1]}×100%,其中m1为朝藿定C初始量，m2为朝藿定C剩余量，m3为淫羊藿苷生成量，M1为朝藿定C相对分子质量，M2为淫羊藿苷相对分子质量。

2.6放大试验

精密称取朝藿定C对照品400 mg,置于圆底烧瓶中，依次加入40 mg/mL牛血清白蛋白100 mL、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 4.5)100 mL、α-L-鼠李糖苷酶800 U,50℃水浴反应72 h,取反应液1 mL,加9 mL甲醇终止反应，混合均匀，测定反应液中朝藿定C、淫羊藿苷含量，计算前者转化率、后者得率，其余反应液煮沸10 min后冷却，抽滤除去固体不溶物，水溶液采用D101树脂浓缩[21]后经制备色谱纯化，得到黄色固体化合物，经1H-NMR、13C-NMR确定结构。

2.7统计学分析

所有实验平行3次，相关数据采用GraphPad Prism 5软件处理，以(x¯±s)表示，通过SPSS 20.0软件进行单因素方差分析。

3、结果

3.1方法学考察

线性关系考察中，朝藿定C回归方程为Y=1 789.6X-2.072 9(r=0.999 9),在0.4～3.6μg范围内线性关系良好；淫羊藿苷回归方程为Y=2 151.4X+2.503(r=0.999 9),在0.2～1.8μg范围内线性关系良好。精密度试验中，朝藿定C、淫羊藿苷峰面积RSD分别为0.09%、0.12%,表明仪器精密度良好。稳定性试验中，朝藿定C、淫羊藿苷峰面积RSD分别为1.52%、3.01%,表明溶液在48 h内稳定性良好。加样回收率试验中，朝藿定C、淫羊藿苷平均加样回收率、RSD分别为101.06%、1.35%;97.12%、1.98%。

3.2单因素试验

3.2.1缓冲液种类

如图1所示，磷酸盐、醋酸-醋酸钠缓冲液均具有较好的效果，但前者更稳定，故选择磷酸盐缓冲液作进一步考察。

图1缓冲液种类对酶水解反应的影响   

3.2.2 pH值

如图2所示，当pH值为3.5～4.5时，朝藿定C转化率升高，淫羊藿苷得率接近100%;高于4.5时，朝藿定C转化率逐渐降低，但淫羊藿苷得率无明显变化，故选择4.5作进一步考察。

图2 pH值对酶水解反应的影响   

3.2.3温度

如图3所示，当温度为40～50℃时，朝藿定C转化率升高，在50℃时达到最大值；50℃后朝藿定C转化率降低，而温度对淫羊藿苷得率影响不大，故选择50℃作进一步考察。

图3温度对酶水解反应的影响   

3.2.4底物与酶用量比例

如图4所示，底物与酶用量比例为1∶0.5～1∶2时，淫羊藿苷得率趋于完全定向转化；高于1∶2时，淫羊藿苷得率不断降低，生成副产物淫羊藿次苷I,故选择1∶2作进一步考察。

图4底物与酶用量比例对酶水解反应的影响   

3.2.5反应时间

如图5～6所示，当反应时间为0～24 h时，酶水解效率较快，在24 h时达70%;24 h后酶水解效率升高程度缓慢，在72 h时朝藿定C转化率为96.45%,淫羊藿苷得率为96.79%;96 h后开始出现副产物淫羊藿次苷I,故选择72 h作进一步考察。

图5反应时间对酶水解反应的影响   

图6酶水解朝藿定C色谱图   

3.2.6底物质量浓度

如图7所示，朝藿定C转化率、淫羊藿苷得率随着底物质量浓度增加均有所降低，为2 mg/mL时两者分别为88.68%、92.65%,但与低质量浓度(0.2～1 mg/mL)相比无显著差异(P>0.05);随着其质量浓度进一步增加，朝藿定C转化率、淫羊藿苷得率继续降低(P<0.05),同时反应体系中检测出副产物，故选择2 mg/mL作进一步考察。

图7底物质量浓度对酶水解反应的影响   

3.3放大试验

设定底物质量浓度为2 mg/mL,总反应体系为200 mL,进行3批放大试验，结果见表1。由此可知，朝藿定C水解率与小试结果基本相同，转化率均在88%以上，而且朝藿定C几乎全部转化为淫羊藿苷，副产物生成较少，表明该工艺收率高，重复性好。

表1放大试验结果(n=3)

3.4结构鉴定

1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:12.58 (1H, s, 5-OH), 7.87 (2H, s, 2′, 6′-H), 7.18 (2H, m, 3′,5′-H), 6.64 (1H, d, J=5.4 Hz, 6-H), 5.29 (1H, d, J=1.8 Hz, Rha-1-H), 5.08 (1H, s, 2-H), 3.86 (3H, s, -OCH3),3.39 (2H, m, 1″-H), 1.69 (3H, s, 4″-H), 1.60 (3H, s, 5″-H), 0.79 (3H, d, J=6.1 Hz, Rha-6-H); 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ:152.9(C-2), 136.2(C-3), 161.9(C-4), 158.6(C-5), 98.6(C-6), 162.0(C-7), 108.8(C-8), 157.5(C-9), 105.0(C-10), 122.6(C-1′), 130.6(C-2′), 114.6(C-3′,C-5′), 161.9(C-4′), 130.0(C-6′,C-3″), 21.9 (C-1″), 122.6(C-2″), 25.9 (C-4″), 18.3 (C-5″), 56.0(-OCH3), 101.0(Rha-C-1), 75.0(Rha-C-2), 70.6(Rha-C-3), 71.8(Rha-C-4), 70.7(Rha-C-5), 18.0(Rha-C-6), 101.2(Glc-1), 73.8(Glc-2), 76.0 (Glc-3), 69.3(Glc-4), 77.1(Glc-5), 61.1(Glc-6)。ESI-MS m/z: 677.243 16 [M+H]+。以上数据与文献[21]报道基本一致，鉴定为淫羊藿苷。

4、讨论与结论

酸水解、微生物转化等方法易将朝藿定C中的糖基全部水解，反应不易控制，并且分离纯化难度大，不利于工业化应用，故本实验水解商品化的α-L-鼠李糖苷酶来制备淫羊藿苷，采用单因素试验考察缓冲液类型、pH值、温度、酶与底物用量比、反应时间、底物质量浓度等条件，并进行工艺放大，发现最优条件为温度50℃,pH 4.5磷酸盐缓冲液，底物与酶用量比例1∶2;当底物质量浓度为2 mg/mL,转化时间为72 h时，朝藿定C转化率为88.68%,淫羊藿苷得率为92.65%。

本实验所使用的α-L-鼠李糖苷酶为国产商品化酶制剂，酶活力仅为0.2 U/mg,无法达到文献[18,19]中重组酶比活力和短时间内水解完全的效果，但其价格仅为文献[20]中所使用酶的1/2,故延长反应时间可达到相对完全水解朝藿定C的目的，而且底物质量浓度达2 mg/mL,高于文献[18,19,20]报道的1 mg/mL。放大试验结果显示，在底物质量浓度2 mg/mL、反应体系200 mL条件下朝藿定C转化率均在88%以上，淫羊藿苷产率均在90%以上，并且几乎无副产物生成。

综上所述，本实验利用α-L-鼠李糖苷酶对朝藿定C的高选择性来进行不同品种淫羊藿的酶转化，通过酶水解获得高含量提取液，再以吸附柱色谱进行分离纯化，该工艺具有易于控制、底物质量浓度和转化率高、稳定性好、后续处理过程简便、成本低廉的优点，有望应用于相关工业化生产。

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[9]李瑞云,刘聪燕,许婷,等.交联纳米SiO2固定化蜗牛酶的制备表征及转化淫羊蓉苷研究[J].中草药,2019. 50(20):4904-4910.

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[16]李丹凤淫羊蓖黄酮水解产物化学成分的研究[D].大连:大连工业大学, 2009.

基金资助:陕西省自然科学基础研究计划项目(2022JM-576); 陕西省重点研发计划项目(2022SF-406); 陕西省教育厅服务地方专项项目(22JC024); 秦巴生物资源与生态环境重点实验室(培育)“市校共建”科研专项(SXC-2302);

文章来源:陈旺,张月,张宇航等.α-L-鼠李糖苷酶水解朝藿定C制备淫羊藿苷工艺研究[J].中成药,2023,45(08):2472-2476.