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HPLC法同时测定清热暗疮片中10种成分

2023-08-19 102 上传者：管理员

摘要：建立HPLC法同时测定清热暗疮片中绿原酸、栀子苷、异绿原酸A、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量。方法该药物甲醇提取液的分析采用Thermo Scientific Hypersil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm);流动相乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱；体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;检测波长225 nm。结果 10种成分在各自范围内线性关系良好(r≥0.999 1),平均加样回收率98.46%～100.94%,RSD 0.63%～1.09%。结论该方法简便灵敏，重复性好，可用于清热暗疮片的质量控制。

关键词：
HPLC
中药制剂
化学成分
清热暗疮片
清热解毒
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清热暗疮片是由金银花、大黄浸膏、穿心莲浸膏、人工牛黄、蒲公英浸膏、珍珠层粉、山豆根浸膏、甘草、栀子浸膏组成的中药制剂，具有清热解毒、凉血散瘀、泻火通腑之功效，用于治疗痤疮、疖痛等[1]。方中金银花具有清热解毒、宣散风热之功效，为君药；大黄具有泻下攻积、清热凉血、泻火解毒、祛瘀通经之功效，穿心莲具有清热解毒、凉血、消肿之功效，栀子具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒之功效。但该制剂现行质量标准无含量测定指标，文献[2,3,4]也仅测定大黄酚、大黄素的含量，尚无多成分同时测定含量的报道，不利于控制其质量。因此，本实验参考文献[5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]报道，建立HPLC法同时测定清热暗疮片中绿原酸、栀子苷、异绿原酸A、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量，以期为该制剂质量控制提供依据。

1、材料

1.1仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪、UV-2550型紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司);XSE205型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司);AS10200BDT超声波清洗机(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)。

1.2试剂与药物

绿原酸(批号110753-201716,纯度99.3%)、栀子苷(批号110749-201718,纯度97.6%)、穿心莲内酯(批号110797-201609,纯度99.7%)、脱水穿心莲内酯(批号110854-201509,纯度99.4%)、芦荟大黄素(批号110795-201710,纯度98.3%)、大黄酸(批号110757-201607,纯度99.3%)、大黄素(批号110756-201512,纯度98.7%)、大黄酚(批号110796-201621,纯度99.2%)、大黄素甲醚(批号110758-201616,纯度99.0%)对照品均购自中国食品药品检定研究院；异绿原酸A对照品(批号250034-201907,纯度98.1%)购自上海鸿永生物科技有限公司外。清热暗疮片(广州王老吉药业股份有限公司，批号1602003,1609001,1609002,1801002,0.21 g/片)。乙腈为色谱纯(德国Merck KGaA公司);其余试剂均为分析纯；水为超纯水(自制)。

2、方法与结果

2.1色谱条件

Thermo Scientific Hypersil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm);流动相0.1%磷酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～12 min, 9%～13%B;12～50 min, 13%～47%B;50～70 min, 47%～89%B;70.01～80 min, 9%B);体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;检测波长225 nm;进样量10μL。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液

精密称取绿原酸、栀子苷、异绿原酸A、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为1.302 1、1.150 0、0.775 2、0.300 2、1.719 1、0.060 5、0.057 5、0.074 7、0.164 9、0.062 3 mg/mL的贮备液，精密吸取5 mL,置于50 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.2供试品溶液

取本品20片，除去包衣，研细，取约1.2 g,精密称定，置于具塞磨口锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，称定质量，水浴回流提取45 min,放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，上清液过滤，即得。

2.2.3阴性样品溶液

按处方比例，分别制得缺金银花、缺大黄浸膏、缺穿心莲浸膏、缺栀子浸膏的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3方法学考察

2.3.1线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0 mL,置于50 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，在“2.1”项色谱条件下各进样10μL测定。以对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.2专属性试验

吸取“2.2”项下对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.3.3精密度试验

取对照品溶液10μL,在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得绿原酸、栀子苷、异绿原酸A、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积RSD分别为0.25%、0.23%、0.78%、0.38%、0.28%、0.32%、0.47%、0.93%、0.47%、0.39%,表明仪器精密度良好。

表1各成分线性关系

2.3.4重复性试验

取同一批本品(批号1609002)6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得绿原酸、栀子苷、异绿原酸A、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量RSD分别为0.69%、0.66%、0.79%、0.68%、0.65%、0.91%、0.88%、0.52%、0.40%、1.17%,表明该方法重复性良好。

图1各成分HPLC色谱图

2.3.5稳定性试验

取同一份供试品溶液，室温下于0、2、6、12、18、24 h在“2.1”项色谱条件下各进样10μL测定，测得绿原酸、栀子苷、异绿原酸A、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积RSD分别为0.71%、0.49%、0.95%、0.65%、0.43%、0.50%、0.76%、0.69%、1.01%、0.68%,表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6加样回收率试验

取各成分含量已知的本品(批号1609002)6份，每份约0.6 g,精密称定，精密加入对照品贮备液2.5 mL、甲醇47.5 mL,在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，绿原酸、栀子苷、异绿原酸A、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚平均加样回收率(RSD)分别为99.30%(0.88%)、99.61%(0.96%)、99.53%(0.94%)、99.37%(1.09%)、99.87%(0.98%)、99.15%(0.83%)、98.46%(0.75%)、100.37%(0.71%)、100.43%(0.93%)、100.94%(0.63%)。

2.4样品含量测定

取4批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

3、讨论

3.1指标成分选择

前期报道，金银花主要有效成分为有机酸类的绿原酸、异绿原酸A,栀子主要有效成分为环烯醚萜类的栀子苷，穿心莲主要有效成分为二萜内酯类的穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯，大黄主要有效成分为蒽醌类的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。因此，本实验选择上述成分进行含量测定。

表2各成分含量测定结果(n=3)

3.2检测波长选择

本实验称取各对照品适量，甲醇溶解并稀释至适宜质量浓度，在200～500 nm波长范围内进行扫描，发现绿原酸在221、246、329 nm,栀子苷在236 nm,异绿原酸A在220、244、330 nm,穿心莲内酯在225 nm,脱水穿心莲内酯在249 nm,芦荟大黄素在225、254 nm,大黄酸在227、257 nm,大黄素在221、254、266、289 nm,大黄酚在225、256 nm,大黄素甲醚在223、265、288 nm处有最大吸收。为了操作简便，使各成分能在同一波长下检测，根据紫外扫描图谱结合含量测定灵敏度要求，选择检测波长为225 nm。

3.3提取方法选择

参考文献[5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]报道，本实验考察了超声、回流提取，发现5个大黄蒽醌类化合物在回流提取时回收率更高，而其他5个无明显差异。再考察了不同体积分数甲醇(50%、75%、100%),发现甲醇提取时效率最高，杂质干扰峰最少。然后，考察了不同提取时间(30、45、60 min),发现提取45 min后各成分含量不再升高。最终确定，提取方法为甲醇回流提取45 min。

3.4流动相选择

参考文献[8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]报道，本实验考察了乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水，发现甲醇-水洗脱时绿原酸不出峰，大黄酸色谱峰拖尾严重；与甲醇-0.1%磷酸比较，乙腈-0.1%磷酸洗脱时洗脱能力更强，基线更平稳，各成分色谱峰峰形、分离度更理想。最终确定，流动相为乙腈-0.1%磷酸。

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