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探讨6种植物激素与岩藻黄素积累和威氏海链藻生长的关联性

2020-07-16 199 上传者：管理员

摘要：比较茉莉酸甲酯、吲哚丁酸、6-苄基氨基腺嘌呤、赤霉素、氯吡苯脲和脱落酸对威氏海链藻的生长及岩藻黄素积累的影响.结果表明,6种激素对威氏海链藻生物量的积累和岩藻黄素含量的提高都有不同程度的调节作用.其中,茉莉酸甲酯、吲哚丁酸和6-苄基氨基腺嘌呤作用效果较好(P<0.05),最佳添加浓度分别为200、30、2μmol•L-1;赤霉素、氯吡苯脲、脱落酸对威氏海链藻生物量存在促进作用,但对其岩藻黄素积累作用效果不显著(P>0.05).

关键词：
威氏海链藻
岩藻黄素
植物学
植物激素
生物量
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威氏海链藻为一种典型的浮游硅藻,具有生长速度快,硅质化程度高等优点,并且其壳体机械性能良好、比表面积大、光学性能优异,是潜在的良好的新型纳米材料[1,2].同时作为一种适合大规模培养的饵料藻,威氏海链藻广泛用于水产养殖中,因其含有较丰富的岩藻黄素,有助于提高饲喂的水产品的质量.

植物激素普遍存在于高等植物中,作为信号分子在介导多细胞植物的生长、发育和环境胁迫反应方面起着至关重要的作用[3].目前,关于微藻的激素产生和功能调控方面的研究,远远落后于高等植物.越来越多的研究表明微藻中含有植物激素[4],能影响藻类的生长发育和形态建成,不同的植物激素对藻类的生长具有不同的调节作用[5,6,7].目前的研究证实单细胞藻中存在生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸和油菜素内酯等内源性植物激素[8,9],然而外源性植物激素对藻类生长和产物积累的报道不多.

岩藻黄素是硅藻中重要的活性物质,表现出抗癌[10,11,12,13]、降血糖[14]、减肥[15,16]、抗氧化[17]、抗痘[18]等多种生理功能,具有潜在商业开发价值.由于人工合成岩藻黄素生产条件苛刻,成本高,限制了其规模化生产,而天然的岩藻黄素广泛存在于褐藻、金藻和硅藻等易于培养、价格低廉的微藻中,因此利用微藻生产岩藻黄素具有独特的优势.

岩藻黄素的合成代谢路径的研究尚未完全揭示,俞凯[19]、管悦琳等[20]研究发现通过茉莉酸甲酯,乙酰水杨酸等化学物质的刺激可调控三角褐指藻crtiso基因和lcyb基因表达,并且两个基因都与岩藻黄素的积累呈线性关系.非生物胁迫(高光强、营养盐限制等)可诱导微藻储能物质的含量,但因其影响微藻的生物量,从而限制了储能物质的高效积累.而植物激素作为化学信使调控植物细胞活动的一类小分子物质,可对微藻的生理代谢活动产生调控作用,包括促进微藻细胞分裂,增加胁迫耐受,提高光合作用效率,从而提高藻类生物量,增加油脂、色素和蛋白质含量[21].

本文以威氏海链藻为研究对象,通过分析不同浓度水平的茉莉酸甲酯、吲哚丁酸、6-苄基氨基腺嘌呤、赤霉素、氯吡苯脲和脱落酸对藻生长和岩藻黄素含量的影响,旨在找出既能促进藻细胞生长又能促进岩藻黄素积累的激素及最佳浓度,为威氏海链藻规模化生产岩藻黄素提供参考依据.

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1藻种

威氏海链藻ND-8,由本实验室分离并保存.

1.1.2培养基

采用f/2培养基[22]进行培养.

1.1.3主要试剂

吲哚丁酸、赤霉素、茉莉酸甲酯、6-苄基氨基腺嘌呤、脱落酸,均为分析纯,中国医药集团有限公司;氯吡苯脲,分析纯,阿拉丁试剂有限公司;丙酮、甲醇,均为分析纯,中国医药集团有限公司;岩藻黄素,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司.

1.1.4主要仪器

TES1339P光照度计,中国台湾泰仕TES电子工业股份有限公司;5804R高速离心机,德国艾本德股份公司;PrimoStar正置显微镜,德国蔡司公司;LGJ-12真空冷冻干燥机,北京松源华兴生物技术有限公司;ACQUITYUPLCTM超高效液相色谱,美国沃特世公司.

1.2方法

1.2.1海水的预处理和培养基

天然海水,采用0.45μm的水系滤膜过滤,121℃20min灭菌后用于配置f/2培养基.

1.2.2藻的培养和细胞数量的统计

采用f/2培养基培养,培养条件为(21±2)℃,光照强度50μmol·m2·s-1,光暗周期12h∶12h,培养7d,每天摇动3次,每次1min.每天定时取样,用卢氏碘液固定藻液,在显微镜下用血球计数板计数.

1.2.3生物量的测定

收集生长7d的威氏海链藻,8000r·min-1离心5min,蒸馏水洗涤2～3次去除海水中的盐离子,-80℃冰箱保存.

从超低温冰箱取出离心收集的藻,泥置于真空冷冻干燥机冷冻干燥40h,干燥结束后用分析天平称取重量,生物量(dw)计算公式如下:

dw=m2-m1(dw为生物量(g);m2为干燥后的总质量(g);m1为离心管的质量(g)).

1.2.4岩藻黄素的提取和检测

在无光或弱光的条件下,每个样品按1g干藻粉加入100～130mL,4℃预冷的混合溶液(V(丙酮)∶V(甲醇)=1∶1),涡旋20～30s,4℃冰箱避光浸提45min.浸提结束后,10000r·min-1,离心5min,上清液即为岩藻黄素粗提液.将上清液用孔径为0.22μm的有机微孔滤膜过滤,用于后续色谱检测.

参照Avula等[23]的方法采用超高效液相色谱对岩藻黄素进行检测.

柱类型和条件:C18柱(2.1×50mm),粒径1.7μm,带保护柱;检测器:二极管阵列检测器;检测波长:447nm;流速:0.25mL·min-1;柱温:室温;流动相:A:乙腈(含0.05%甲酸);B:超纯水(含0.05%甲酸);洗脱程序:0～4min,65%A～100%A,4～7min100%A维持,7～8min,100%A洗脱到65%A,8～12min,65%A.

1.2.5实验组的设置

在培养基中以接种比例为1∶8接入对数期的威氏海链藻,f/2培养基中分别加入不同浓度的6种植物激素(表1),并以不加激素的f/2培养基作为对照组(每组设置3个重复试验).

表1激素单因子实验设计表

注:A:茉莉酸甲酯;B:吲哚丁酸;C:6-苄基氨基腺嘌呤;D:赤霉素;E:氯吡苯脲;F:脱落酸.

1.2.6数据处理

采用统计软件SPSS19.0处理相关数据,用Duncan氏多重比较法对各实验处理间的差异显著性进行比较分析,图表制作软件为origin8.5.

2、结果与分析

2.1茉莉酸甲酯对威氏海链藻的生长和岩藻黄素积累的影响

比较不同浓度茉莉酸甲酯对威氏海链藻细胞密度的影响(图1a)发现,在一定的浓度范围内,较高浓度的茉莉酸甲酯有助于威氏海链藻细胞密度的增长,但当茉莉酸甲酯浓度为250μmol·L-1时对威氏海链藻细胞密度的促进作用在后期不明显,甚至有抑制作用.由图1b可知,茉莉酸甲酯浓度为50、100、150、200μmol·L-1的实验组与对照组相比较均存在极显著差异(P<0.01).当茉莉酸甲酯浓度为200μmol·L-1时,威氏海链藻最终得到的生物量为最高,与0、50、150、250μmol·L-1实验组存在极显著差异(P<0.01);岩藻黄素积累总量最高,与0、50、100、250μmol·L-1实验组存在极显著差异(P<0.01).

2.2吲哚丁酸对威氏海链藻的生长和岩藻黄素积累的影响

比较不同浓度吲哚丁酸对威氏海链藻细胞密度的影响发现,较高浓度的吲哚丁酸有助于威氏海链藻细胞密度的增长,尤其在培养至4d到6d时,效果极为明显.培养至第7天时除对照组及浓度为30μmol·L-1的实验组外,其他实验组均出现了不同程度细胞密度降低的现象.但从图2b可观察到与对照组相比除了浓度为5μmol·L-1和10μmol·L-1的实验组细胞干质量有所下降外,其他实验组的生物量均上涨.吲哚丁酸浓度为30μmol·L-1时,威氏海链藻生物量最高,与浓度为0、5、10、15μmol·L-1实验组存在极显著差异(P<0.01).实验组浓度为20μmol·L-1和30μmol·L-1时岩藻黄素总量较高,两组之间不存在极显著差异(P>0.01),但均与对照组及浓度为5μmol·L-1实验组存在极显著差异(P<0.01),与10、15μmol·L-1的实验组不存在极显著差异(P>0.01).

图1不同浓度的茉莉酸甲酯对威氏海链藻细胞密度、生物量、岩藻黄素总量的影响

注:数据均为平均值±标准差(n=3).柱形图上标有不同字母表示在0.01水平有显著差异.

图2不同浓度的吲哚丁酸对威氏海链藻细胞密度、生物量、岩藻黄素总量的影响

注:数据均为平均值±标准差(n=3).柱形图上标有不同字母表示在0.01水平有显著差异.

2.36-苄基氨基腺嘌呤对威氏海链藻的生长和岩藻黄素积累的影响

比较不同浓度的6-苄基氨基腺嘌呤6-苄基氨基腺嘌呤对威氏海链藻生物量与岩藻黄素积累的作用(图3a和图3b)发现,随浓度升高呈现先促进达到一定浓度后抑制再随浓度升高呈促进的效果,较高浓度有利于生物量积累,较低浓度有助于威氏海链藻岩藻黄素积累.6-苄基氨基腺嘌呤浓度为10μmol·L-1时,威氏海链藻生物量最高,与对照组及8μmol·L-1实验组存在显著差异,但与2、4、6μmol·L-1实验组差异不显著.实验组浓度为2μmol·L-1时,岩藻黄素总量最高,与对照组及浓度为8μmol·L-1实验组比较存在显著差异.

2.4赤霉素对威氏海链藻的生长和岩藻黄素积累的影响

比较不同浓度赤霉素对威氏海链藻细胞密度的影响发现(图4a),在第5d到第7d加入赤霉素浓度为1μmol·L-1的实验组细胞密度降低,其他实验组的细胞密度均有一定升高.由图4b可知,赤霉素浓度为10μmol·L-1时,生物量最高与对照组及其余实验组之间存在极显著差异(P<0.01),岩藻黄素总量较其余实验组低,但较对照组高但均不存在显著差异.浓度为1μmol·L-1的实验组细胞干质量与图4a的细所占数量中显示不符,可能为藻体死亡积累的藻壳质量.所有实验组的岩藻黄素积累总量较对照组都有一定的提高,但差异不显著.

图3不同浓度的6-苄基氨基腺嘌呤对威氏海链藻细胞密度、生物量、岩藻黄素总量的影响

注:数据均为平均值±标准差(n=3).柱形图上标有不同字母表示在0.05水平有显著差异.

图4不同浓度的赤霉素对威氏海链藻细胞密度、生物量、岩藻黄素总量的影响

注:数据均为平均值±标准差(n=3).柱形图上标有不同字母表示在0.01水平有显著差异.

2.5氯吡苯脲对威氏海链藻的生长和岩藻黄素积累的影响

比较不同浓度氯吡苯脲对威氏海链藻细胞密度的影响(图5a,图5b)发现,较低浓度的氯吡苯脲有助于威氏海链藻细胞密度的增长,当其浓度高于1μmol·L-1时的其余实验组均对藻的生物量及其岩藻黄素积累有抑制作用.氯吡苯脲浓度为5μmol·L-1时,威氏海链藻生物量和岩藻黄素总量均为最低,与对照组及浓度为1μmol·L-1实验组相较均存在显著差异(P<0.05).氯吡苯脲浓度为1μmol·L-1时,生物量最高,岩藻黄素总量最高,与较高浓度5μmol·L-1的实验组比较均存在显著差异(P<0.05),但与对照组相比均无显著差异.因此,氯吡苯脲对威氏海链藻的生物量及岩藻黄素积累无显著促进作用.

图5不同浓度的氯吡苯脲对威氏海链藻细胞密度、生物量、岩藻黄素总量的影响

注:数据均为平均值±标准差(n=3).柱形图上标有不同字母表示在0.05水平有显著差异.

2.6脱落酸对威氏海链藻的生长和岩藻黄素积累的影响

比较不同浓度赤霉素对威氏海链藻细胞密度的影响发现(图6a),较高浓度的脱落酸有助于威氏海链藻细胞密度的增长.由图6b可知,脱落酸浓度为7.5μmol·L-1时,生物量最高,与对照组相比较存在显著差异(P<0.05),与其它四组相比较没有显著差异.浓度为4.5μmol·L-1时岩藻黄素总量最高,但各实验组间不存在显著差异.因岩藻黄素积累总量各组间数据未存在显著差异,所以脱落酸对威氏海链藻产岩藻黄素影响不大.

图6不同浓度的脱落酸对威氏海链藻细胞密度、生物量、岩藻黄素总量的影响

注:数据均为平均值±标准差(n=3).柱形图上标有不同字母表示在0.05水平有显著差异.

3、结论

本文研究了茉莉酸甲酯、吲哚丁酸、6-苄基氨基腺嘌呤、赤霉素、氯吡苯脲和脱落酸对威氏海链藻的生物量及岩藻黄素积累的影响.结果表明,6种激素在不同浓度下对威氏海链藻的生长及岩藻黄素含量的积累都存在着不同程度的调控作用.其中,茉莉酸甲酯、吲哚丁酸、6-苄基氨基腺嘌呤作用效果较好,最佳添加浓度分别为:200、30、2μmol·L-1,分别可使威氏海链藻的生物量提高336.1%、39.4%、22.9%,岩藻黄素总量提高412%、33.8%、26.1%.而赤霉素、氯吡苯脲和脱落酸作用不明显,这3种激素在不同浓度下对藻细胞的生长均有促进作用,但对岩藻黄素的积累作用不显著.

参考文献:

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基金:国家海洋局“十三五”海洋经济创新发展示范项目(FZHJ14);福建师范大学生命科学学院“溪源江学者”扶持计划.