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白杨素磷脂复合物固体分散体的制备及其体内药动学研究

2021-10-19 77 上传者：管理员

摘要：目的制备白杨素磷脂复合物固体分散体,并考察其体内药动学。方法溶剂挥发法制备固体分散体,测定体外溶出、表观溶解度,采用XRPD进行晶型分析。大鼠灌胃给药（20mg/kg）后,于0.167、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、8、12h采血,HPLC法测定白杨素血药浓度,计算主要药动学参数。结果药载比（磷脂复合物-PVPK30）为1∶6时,固体分散体240min内累积溶出度达94.6%。白杨素在固体分散体中以无定型状态存在。与原料药、磷脂复合物比较,固体分散体在水、正辛醇中的表观溶解度升高（P<0.01）,tmax缩短（P<0.05）,Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P<0.01）,相对生物利用度增加至2.16倍。结论固体分散体可改善白杨素磷脂复合物的体外溶出度和体内生物利用度。

关键词：
HPLC
XRPD
体内药动学
制备
固体分散体
溶剂挥发法
白杨素
磷脂复合物
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白杨素是蜂胶主要有效成分，也可从紫葳科植物木蝴蝶中提取得到，具有抗菌、抗肿瘤、降血脂、抗糖尿病、预防心脑血管疾病等作用[1,2],研发价值较高，但由于该成分水溶性和脂溶性较差，口服生物利用度较低，导致临床应用受到很大限制[3]。崔晓鸽等[3]采用磷脂复合物技术，在一定程度上提高了白杨素体内吸收，但其疏水性较强，从而影响了药物溶解度和溶出度[4,5,6,7,8],故需要联合其他制剂技术以进一步提高其口服吸收生物利用度。

固体分散体是指通过熔融法、溶剂挥发法等制剂技术，将药物分散于亲水载体(如PVPK30等)中的一种固体粉末，有助于增加亲水性，改善溶解度，提高溶出速率和溶出度，也可进一步促进药物口服吸收[9,10,11,12]。因此，本实验采用聚乙烯吡咯烷酮K30(PVPK30)将白杨素磷脂复合物进一步制成固体分散体，对其存在状态、溶解度、体外溶出等进行了研究，并考察了其体内药动学。

1、材料

1.1 仪器

UW220H型电子分析天平(日本岛津公司);U3000型高效液相色谱仪(美国戴安公司);YSCL-3A型集热式加热磁力搅拌器(上海秋佐科技设备有限公司);TR6120-AT型溶出试验仪(配置自动取样仪，深圳市锐拓仪器设备有限公司);HT-110X50型恒温振荡器(上海赫田科学仪器有限公司);SPR-DT12A-12型智能药物溶出仪(天津赛普瑞实验设备有限公司);D8ADV型X射线粉末衍射仪(德国Bruker公司)。

1.2 试剂与药物

白杨素对照品(纯度99.1%,批号111701-201501,中国食品药品检定研究院);白杨素原料药(纯度>98.5%,批号171213P,西安一品生物科技有限公司)。大豆磷脂(批号191005,辅必成医药科技有限公司);聚乙烯吡咯烷酮K30(PVPK30,批号201548234-3,德国巴斯夫公司)。四氢呋喃为色谱纯(德国Merck公司);正辛醇(批号190915)、无水乙醇(批号191110)(国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 动物

清洁级SD大鼠，雌雄兼用，体质量(280±20)g,购自河南省动物实验中心，动物生产许可证号SCXK-2016-0001,饲养于相对湿度40%～55%、温度20～25℃环境下。

2、方法与结果

2.1 白杨素含量测定

2.1.1 色谱条件

ZORBAXSBC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相乙腈-0.1%磷酸(55∶45);体积流量1.0mL/min;柱温30℃;检测波长268nm;进样量20μL。

2.1.2 线性关系、方法学考察

精密称取白杨素对照品20mg,溶于100mL乙腈中，作为贮备液(0.2mg/mL),精密量取适量，“2.1.1”项下流动相稀释至10.0、5.0、2.5、1.0、0.5μg/mL,在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以白杨素质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=19.4814X-2.1591(r=0.9996),在0.5～10.0μg/mL范围内线性关系良好。

取10.0、5.0、0.5μg/mL上述溶液各3份，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得日内精密度RSD分别为0.12%、0.16%、0.24%,日间精密度RSD分别为0.51%、0.47%、0.83%。取约10mg白杨素磷脂复合物固体分散体至100mL量瓶中，流动相溶解定容，过滤后取续滤液5mL至10mL量瓶中，流动相定容，作为供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、24h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得白杨素峰面积RSD为1.06%,表明溶液在24h内稳定性良好。取白杨素含量已知的磷脂复合物10mg,分别加入贮备液1、1.5、2.0mL,同法制备供试品溶液各3份，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得白杨素平均加样回收率分别为100.14%、99.83%、99.69%,RSD分别为1.06%、0.83%、1.34%。取对照品溶液适量，流动相逐步稀释，分别以信噪比(S/N)10、3为定量限、检测限，测得两者分别为10、5ng/mL。

2.2 白杨素磷脂复合物及其固体分散体制备

称取白杨素25.4mg、磷脂93.6mg(摩尔比为1∶1.2),加入四氢呋喃后密封，置于45℃水浴中磁力搅拌4h,减压旋蒸，即得磷脂复合物，为浅黄色半固体状的残留物，置于干燥器中保存。同法制备3批，参考文献[3]报道测得其复合率均接近100%。

取白杨素磷脂复合物、PVPK30适量，加入无水乙醇得混悬液，密封，置于45℃水浴中磁力搅拌至溶液澄清，减压旋蒸得残留物，即得固体分散体，粉碎，过60目筛，保存于干燥器中备用。

2.3 体外释放研究

取白杨素磷脂复合物及不同载体比例的固体分散体(以白杨素计，含量均为15mg),加入3mL空白溶出介质配制混悬液，转入透析袋中并扎紧[12](截留分子量为8000～14000Da),设定仪器温度、转速分别为37℃、100r/min,溶出介质为0.5%SDS溶液，体积为900mL,于0、15、30、60、90、120、240、360、480、720min各取样3mL,补加3mL空白溶出介质，维持总体积不变，6000r/min离心10min,取上清液进样分析。

2.4 磷脂复合物与载体比例筛选

图1显示，原料药720min内累积溶出度仅为20.92%,而磷脂复合物提高至43.51%;磷脂复合物与载体PVPK30比例为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8时，均可提高白杨素溶出速率和溶出度，而且随着后者用量增加更明显，综合考虑溶出速率、溶出度、固体分散体中药物含量等因素，最终确定两者比例为1∶6。

2.5 X射线粉末衍射(XRPD)分析

取原料药、物理混合物(白杨素+磷脂+PVPK30)、磷脂复合物、固体分散体适量，置于玻璃内槽中，玻璃片压制平整后进行XRPD扫描，设定条件为Cu-Kα靶，电压40kV,范围(2θ)3°～45°,速度8°/min,结果见图2。由此可知，原料药图谱中可见特征晶型峰，并且在物理混合物图谱中仍存在；虽然磷脂XRPD图谱中也有晶型峰[3],但本实验在物理混合物图谱中未发现，这与PVPK30用量远大于磷脂用量有关，导致后者XRPD被掩盖；磷脂复合物图谱中无白杨素特征晶型峰，表明该成分以无定型状态存在；在固体分散体图谱中也未发现白杨素特征晶型峰，表明该成分仍以无定型状态存在。

2.6 溶解性研究

取过量原料药、磷脂复合物、固体分散体适量，置于三角瓶中，加入适量正辛醇或蒸馏水，25℃水浴中磁力搅拌12h,取上层混悬液，6000r/min离心5min,取上清液过滤，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见表1。由此可知，将白杨素制成磷脂复合物后，在水、正辛醇中表观溶解度分别提高至3.21、11.11倍(P<0.01);将磷脂复合物进一步制成固体分散体后，在正辛醇中表观溶解度无明显变化(P>0.05),而在水中提高了3.53倍(P<0.01),表明将磷脂复合物制成固体分散体后可大大提高前者水溶性，而且对脂溶性无影响。

2.7 体内药动学研究

2.7.1 药液制备

取原料药、磷脂复合物、固体分散体适量，0.5%CMC-Na溶液制成含2mg/mL白杨素的混悬液，即得。

2.7.2 分组、给药与采血

取大鼠18只，给药前禁食12h,随机分为3组，分别灌胃给予“2.7.1”项下3种药液，剂量均为20mg/kg。参考文献[3]报道及预实验结果，乙醚麻醉大鼠后于0.167、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、8、12h迅速眼眶采血0.2～0.3mL,置于肝素抗凝处理的离心管中，手动振荡，2500r/min离心20min,取血浆，密封，保存在冰箱冷冻层。

2.7.3 血浆样品处理

量取正己烷100mL、二氯甲烷50mL、异丙醇10mL,混匀后超声提取5min,作为血浆样品提取液，室温解冻后取100μL至离心管中，加入内标溶液(称取柚皮素对照品10mg,溶于25mL乙腈中，即得，质量浓度为400ng/mL)80μL、提取液3mL,于通风橱中涡旋混合5min,静置30min,转移有机相至空白离心管中，45℃氮气吹干(注意控制氮气体积流量),加入100μL流动相复溶，8000r/min离心5min后进样分析。

2.7.4 血浆对照品溶液制备及线性关系考察

取“2.1.2”项下白杨素对照品贮备液，乙腈逐步稀释至20、50、100、500、1000、1500ng/mL,各取500μL,45℃氮气吹干后加入500μL大鼠空白血浆，即得质量浓度为20、50、100、500、1000、1500ng/mL的血浆对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以白杨素、内标(柚皮素)峰面积比值为纵坐标(Y),白杨素质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为Y=0.1683X+0.1012(r=0.9934),在20～1500ng/mL范围内线性关系良好。

2.7.5 方法学考察

取20、500、1500ng/mL血浆对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下各进样测定6次，测得日内精密度RSD分别为2.16%、1.95%、2.00%,6d内日间精密度RSD分别为10.14%、8.43%、5.69%,表明该方法精密度良好。取血浆样品，按“2.7.3”项下方法处理，于0、4、8、12、24、48h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得白杨素、内标峰面积比值RSD为9.18%,表明样品稳定性良好。取1只大鼠，按20mg/kg剂量灌胃给予白杨素混悬液，1.5h后眼眶采血约3.5mL,处死，取血浆，分为6份，按“2.7.3”项下方法处理，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得白杨素、内标峰面积比值RSD为10.83%,表明该方法重复性良好。取大鼠空白血浆，配制低(20ng/mL)、中(500ng/mL)、高(1500ng/mL)质量浓度样品溶液，按“2.7.3”项下方法处理，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得平均加样回收率在87.19%～97.46%之间。取20ng/mL血浆对照品溶液，逐步稀释后在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得检测限约为2.0ng/mL,定量限约为5.0ng/mL。

2.7.6 结果分析

血药浓度-时间曲线见图3,再采用3P97程序统计矩模型计算药动学参数，结果见表2。由此可知，与原料药比较，磷脂复合物Cmax、AUC0～t升高(P<0.05,P<0.01),与文献[3]报道基本一致；与磷脂复合物比较，固体分散体tmax缩短(P<0.05),Cmax、AUC0～t升高(P<0.01)。另外，磷脂复合物、固体分散体相对生物利用度分别增加至1.44、2.16倍。

3、讨论

磷脂分子中2条长脂肪链包裹白杨素分子，同时通过氢键、范德华力等作用力结合在一起而形成磷脂复合物[11],它继承了磷脂既亲水又亲脂的特性，从而使白杨素水溶性、脂溶性均有所提高，但前者幅度一般不大，这是因为磷脂是一种疏水性物质，而且磷脂复合物一般以半固体形式存在，分散性差，在一定程度上影响了药物体外溶出度，不利于其生物利用度的提高[13]。

本实验结果显示，固体分散体可提高白杨素磷脂复合物的水溶性及体外溶出度，可能是由于亲水性材料PVPK30包裹了磷脂复合物，从而增强了其亲水性，而且PVPK30用量是磷脂复合物的6倍，可使后者高度分散于载体材料中，有助于提高其水溶性、溶出速率、溶出度，促进药物吸收。目前，已有关于白杨素口服纳米制剂的报道[14,15],但其包封率、载药量均不高，制备工艺复杂；本实验报道的白杨素磷脂复合物固体分散体制备工艺更为简单，适合国内中药制药公司的实际生产水平。

综上所述，将白杨素磷脂复合物制成固体分散体后，可解决其水溶性差、溶出速率及累积溶出度低的问题，并能进一步促进药物吸收[16,17]。但药物经胃肠道吸收进入血液循环的过程较为复杂，与其水溶性、脂溶性、酶降解作用等因素均有很大关系，而现有制剂技术无法解决药物所有的吸收瓶颈，导致口服生物利用度的改善情况也会受到影响，今后将作进一步研究。

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