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黄精多糖提取工艺及降糖活性研究

2024-04-08 372 上传者：管理员

摘要：目的:探究黄精多糖的最佳提取工艺和黄精多糖的降血糖功效。方法:以黄精为原料，采用超声辅助提取法，用硫酸-苯酚法在490 nm处测得多糖含量，通过设计单因素实验对不同的料液比、体积分数、提取时间、提取温度进行研究，得出最优的单因素条件，设计正交实验，得到黄精多糖的最佳提取工艺；再通过酶标仪测定黄精多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率，分析其降血糖机制。结果:黄精多糖的最佳提取工艺条件为料液比1∶10、乙醇体积分数70%、提取时间60 min、提取温度60℃,黄精多糖的提取率为1.08%;黄精多糖浓度为8 mg/mL时对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到93.1%,而对α-淀粉酶抑制作用不明显。结论:黄精富含黄精多糖成分，黄精多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率与阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率相接近，具有较好的抑制作用，通过抑制α-葡萄糖苷酶活性从而阻碍葡萄糖的转化，降低血糖浓度。该研究为黄精开发为降糖型保健食品提供有力的数据参考。

关键词：
提取工艺
降糖活性
食补
黄精
黄精多糖
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黄精(Polygonatum Sibiricum)是百合科多年生草本植物[1],《中华人民共和国药典》收录的黄精药材源于鸡头黄精、多花黄精、滇黄精，中药黄精既为药用，又可食补[2],黄精的主要活性成分有黄精多糖、黄精低聚糖、黄精皂苷、黄酮类化合物等[3,4,5],因其功效显著又价廉易得，广泛用于药膳食材。现如今，越来越多人被高血糖、糖尿病、肥胖等疾病困扰[6,7],需寻求具有降糖功效的药膳食品，而有研究表明，人体α-葡萄糖苷酶(以下简称酶)能促进糖苷键的水解使摄入的淀粉或多糖转化为葡萄糖而导致体内糖分增加[8,9],为寻找能抑制α-葡萄糖苷酶水解的物质，从而达到降低体内葡萄糖含量的目的，本文首次将中药黄精作为原料，提取黄精多糖，采用阿卡波糖作为参照，用α-淀粉酶作为对比，尝试将α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶作用于黄精多糖中，探究抑制酶活性和降糖之间存在的关系，为黄精成为降血糖的药膳保健品提供理论依据和数据参考。

1、材料与方法

1.1 实验材料与试剂

黄精：采购于凯里市民族医药市场，经胡秀虹教授鉴定为多花黄精；将黄精清洗干净，切片后晾干，使用高速万能粉碎机将其打成粉末，密封备用。

α-葡萄糖苷酶(100 U/1 KU),α-淀粉酶(3700 U/g),购于金克隆(北京)生物技术有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, p-NPG)、葡萄糖、阿卡波糖，标准品，购于Sigma试剂公司；碳酸钠、磷酸二氢钾、乙醇、氢氧化钠、浓硫酸，均为国产分析纯。

AR2140电子天平，购于奥豪斯国际贸易(上海)有限公司；THZ-A台式恒温振荡器，购于上海搏讯仪器有限公司；FW400A高速万能粉碎机，购于北京科伟永兴仪器有限公司；UP-6T超声波清洗机，购于上海优普实业有限公司；1530-00302C酶标仪，购于成都百乐科技有限公司；UV-2500紫外-可见分光光度仪，购于上海光谱有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的制备

准确称取0.01 g的葡萄糖于100 mL的容量瓶中定容，然后分别取浓度梯度为0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的葡萄糖溶液于试管中，分别加入蒸馏水至1 mL,然后分别加入1 mL 5%的苯酚和5 mL浓硫酸，加入后静置10 min后40 ℃水浴保温15 min, 取出后立即冷却至室温，数分钟后在490 nm的波长处测定吸光度。测定结果吸光度与浓度线性关系见表1;以葡萄糖浓度(mg/L)为横坐标，以吸光度A为纵坐标绘制标准曲线如图1,得到线性回归方程为：y=0.008 9x+0.012 8,R2=0.997 1。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制试验试液准备

67 mmoL/L,pH=6.8的磷酸钾缓冲液配置：准确称取三水合磷酸氢二钾7.647 g和磷酸二氢钾4.559 g混合，溶于500 mL蒸馏水中。

表1 黄精多糖对照品吸光度值导出到EXCEL

图1 葡萄糖标准曲线

0.1 moL/L的碳酸钠溶液配置：称取2.65 g放入烧杯中加少量水溶解后倒入250 mL容量瓶中，洗涤2～3次烧杯，最后定容至刻度。

p-NPG(对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)溶液配置：准确称取0.376 6 g的p-NPG加适量的磷酸钾缓冲液溶解后倒入50 mL容量瓶中，洗涤2～3次烧杯，最后定容至刻度。

α-葡萄糖苷酶溶液配置：称取10 mg α-葡萄糖苷酶放入烧饼中用一定量磷酸钾缓冲液溶解后倒入250 mL容量瓶，洗涤2～3次烧杯，最后定容至刻度。

1.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制试验

提取得到的黄精多糖用磷酸盐缓冲液配置成浓度分别为0.5、1、2、4、8 mg/mL的黄精多糖溶液，然后分别在标好号的试管中加入400 μL磷酸盐缓冲液、400 μL黄精多糖溶液和200 μL的α-葡萄糖苷酶溶液，混合均匀后37 ℃水浴反应15 min, 然后加入200 μL p-NPG溶液后37 ℃水浴继续反应15 min后加入300 L碳酸钠溶液，用酶标仪于波长400 nm处测定吸光度值[10]。

以磷酸钾缓冲液代替多糖样品为空白对照，以阿卡波糖代替多糖为阳性对照，用公式(1)计算多糖溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制率。样品组记为A1,背景组记为A2,空白组记为A3,组间物质见表2。

抑制率I(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100% 公式(1)

1.2.4 α-淀粉酶抑制试验试液准备

α-淀粉酶溶液的配置：准确称取1 mg的α-淀粉酶放入烧杯中，加入10 mL的磷酸钾缓冲液溶解备用。

1%的淀粉溶液的配置：准确称取0.2 g的可溶性淀粉加入10 mL的沸水溶解，之后缓慢加入10 mL的沸水，然后沸水浴2～3 min之后放置室温备用。

表2α-葡萄糖苷酶抑制实验各组物质

1.2.5 α-淀粉酶抑制试验

提取得到的黄精多糖用磷酸盐缓冲液配置成浓度分别为0.5、1、2、4、8 mg/mL的黄精多糖溶液，取多糖溶液500 μL和α-淀粉酶溶液500 μL于具塞试管中，混匀后37 ℃水浴反应0.5 min, 取出后加入2倍体积1%的淀粉溶液，37 ℃水浴反应15 min后立即加入DNS(二硝基水杨酸试剂)显色剂1 mL,沸水浴5 min后冷却至室温，然后加入3倍体积的蒸馏水稀释，在540 nm处测吸光度。

以磷酸钾缓冲液代替多糖样品为空白对照，以阿卡波糖代替多糖样品为阳性对照，利用公式(2)计算多糖溶液对α-淀粉酶的抑制率。样品组记为A4,背景组记为A5,空白组记为A6,组间物质见表3。

抑制率I(%)=[1-(A4-A5)/A6]×100% 公式(2)

表3α-淀粉酶抑制实验各组物质

2、结果与分析

2.1 黄精多糖提取单因素试验

2.1.1 最优料液比的确定

设置5个不同梯度的料液比，其比值分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30。分别称取2 g的黄精粉末5份放于锥形瓶中，贴上标签，依次按顺序加入20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL 60%的乙醇溶液，固定温度60 ℃,超声提取30 min后冷却抽滤，收集滤液至于5个容器中，编号备用。分别在5个容器中取0.2 mL供试品放在试管中分别稀释至25 mL,再分别取出0.2 mL加水至1 mL,随后分别加入1 mL 5%苯酚和5 mL浓硫酸，静置10 min后在40 ℃水浴保温15 min, 放置冷却后在490 nm处测样品浓度，其结果见表4、图2。由图可知随着料液比不断地增加曲线升高，当料液比为1∶15时提取率最大，而后增加料液曲线反而下降，说明料液比为1∶15时提取黄精多糖浓度最高。

表4 料液比对黄精多糖浓度的影响

图2 料液比的影响

2.1.2 最优乙醇体积分数的确定

设计乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%、90%的5个梯度，探究乙醇体积分数对黄精多糖提取率的影响。分别精密称取2.0 g的黄精粉末5份放入标号的锥形瓶中，且以“2.1.1”中所得到的最佳料液比1∶15为固定因素按顺序加入不同体积分数的乙醇，在温度60 ℃中超声提取30 min。冷却后分别抽滤并收集滤液。各取0.2 mL供试品滤液于试管中稀释至25 mL,再分别取出0.2 mL加水至1 mL,分别加入1 mL 5%苯酚和5 mL浓硫酸后静置10 min, 于40 ℃水浴保温15 min后冷却，在490 nm处测样品浓度，其结果见表5、图3。由图可知，乙醇体积分数为80%时提取的黄精多糖浓度最高。

表5 乙醇体积分数对黄精多糖浓度的影响

图3 乙醇体积分数的影响

2.1.3 最优超声时间的确定

设计5个不同提取时间为30 min、45 min、60 min、75 min、90 min, 精密称取2.0 g的黄精粉末5份分别放入标号的锥形瓶中，且以“2.1.1”中所得到的最佳料液比1∶15和“2.1.2”所得最佳乙醇体积分数80%在温度60 ℃中进行不同时长提取。冷却后抽滤并分别收集滤液，并分别取0.2 mL供试品滤液稀释至25 mL,再分别取出0.2 mL加水至1 mL,再分别加入1 mL 5%苯酚和5 mL浓硫酸后静置10 min, 再于40 ℃水浴保温15 min后立即冷却，在490 nm处测样品浓度，其结果见表6、图4。由图可知超声时间60 min时黄精多糖提取浓度最大。

表6 超声时间对黄精多糖浓度的影响

图4 超声时间的影响

2.1.4 最优提取温度的确定

设计5个不同温度梯度分别为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃,精密称取5份2.0 g的黄精粉末分别置于标号的锥形瓶中，且以“2.1.1”中所得到的最佳料液比1∶15,“2.1.2”所得最佳乙醇体积分数80%,“2.1.3”中所得最佳超声时间60 min为固定因素按顺序分别置于不同的温度进行提取，结束后抽滤并收集滤液备用。各取0.2 mL供试品滤液于试管中加水稀释至25 mL,再分别取出0.2 mL加水至1 mL,再依次加入1 mL 5%苯酚和5 mL浓硫酸后静置10 min, 置于40 ℃水浴锅中保温15 min后冷却，在490 nm处测定样品浓度，其结果见表7、图5。由图5可知在70 ℃时提取的黄精多糖含量达到最高。

表7 超声温度对多糖浓度的影响

图5 超声温度的影响

2.2 黄精多糖提取工艺的正交试验

由上述单因素实验提取得到的条件可得，对每一个实验变量选定3个水平4个因素进一步探讨在相近的实验条件下更精准控制变量来提取黄精多糖，得到最佳提取率，即因素与水平因素，见表8。

表8 水平与因素

根据上述所设计的因素水平，设计以L9(34)为正交试验方案提取黄精多糖，且每组实验都在相同的条件下重复3次提取，操作步骤与单因素实验步骤一样，选出黄精多糖提取工艺的优化条件，其试验结果见表9。

表9 L9(34)正交试验结果

根据正交试验表R值可知，影响黄精多糖提取率的因素强度为：乙醇体积分数(B)>料液比(A)>超声提取时间(C)>超声提取温度(D),且由此可知用超声波提取黄精多糖的最佳提取工艺为A1B1C2D1,即料液比1∶10、乙醇体积分数70%、超声提取时间60 min、超声提取温度60 ℃,则黄精多糖的提取率为1.08%。

2.3α-葡萄糖苷酶抑制试验结果

由图6可知：随着浓度的增加黄精多糖与阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用就越明显。在浓度逐渐升高的条件下阿卡波糖抑制率达到97.64%,黄精多糖浓度为8 mg/mL时，其抑制率达到93.11%,而阿卡波糖是较好的抑制α-葡萄糖苷酶参照剂，黄精多糖的抑制率与阿卡波糖抑制率接近，由此说明黄精多糖对于α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制作用。

图6 黄精多糖和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用

2.4α-淀粉酶抑制试验结果

由图7可知：阿卡波糖随着浓度的升高对于α-淀粉酶的抑制作用也逐渐升高，抑制率达到97.79%,而黄精多糖随着浓度的升高对α-淀粉酶的抑制作用不明显，抑制率达到37.17%由此可知黄精多糖对于α-淀粉酶抑制作用较小。

图7 黄精多糖和阿卡波糖对α-淀粉酶抑制作用

3、结论与讨论

本实验利用超声波辅助提取黄精药材中的多糖，超声提取考察了料液比(A)、乙醇体积分数(B)、超声提取时间(C)、超声提取温度(D)4个因素对黄精多糖提取率的影响，然后通过正交试验得出最佳提取工艺，得到最优提取工艺为料液比1∶10、乙醇体积分数70%、超声提取时间60 min、超声提取温度60 ℃。另外，利用酶标仪测定提取的黄精多糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用，计算抑制率。通过数据显示黄精多糖对于α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用，在浓度为8 mg/mL时抑制率达到93.11%,与α-葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖具有相近的抑制作用。而对于α-淀粉酶的抑制作用较低，抑制作用仅达到37.17%,抑制作用效果不明显。由此得出黄精能够通过抑制α-葡萄糖苷酶活性，从而抑制糖类分解形成葡萄糖，抑制血糖升高，因此表明黄精多糖对于降血糖有一定的效果。

本实验通过黄精多糖对α-葡萄糖苷酶的体外抑制试验，进一步得出黄精多糖可抑制α-葡萄糖苷酶活性进而抑制糖类物质分解成葡萄糖，说明黄精对于降低血糖具有较好的作用，为黄精开发为降糖型保健食品提供有力的数据参考。

参考文献:

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基金资助:贵州省教育厅自然科学研究基金青年科技人才成长项目(黔教合KY字[2019]191);