摘要:以甘麦大枣汤为研究对象,以5-二十一烷基间苯二酚(ARs-21)提取量为主要评价指标,通过单因素试验结合响应面试验对水提法、醇提法、水提醇沉法3种提取工艺条件进行优化,并对其提取液的主要理化指标和生产成本进行对比分析。结果表明:醇提法最佳提取条件为料液比1∶30,乙醇质量浓度505 g/L,提取时间43 min,该工艺条件下所得提取液的颜色、状态良好,ARs-21和总黄酮提取量均较高,但工业成本也较高;水提法最佳提取条件为料液比1∶31,提取温度90℃,提取时间36 min,该工艺条件下所得提取液的干浸膏得率较高、粒径较小且成本较低,适用于大规模生产,但存在提取液颜色较深、黏度较大的问题,且ARs-21和总黄酮提取量均低于醇提法提取液;水提醇沉法在醇沉后提取液会产生白色微黄絮状沉淀,且无法回溶,产品品质稳定性较差,不适用于甘麦大枣汤的提取。
中药广泛应用于医疗与食品行业,在世界范围内越来越受到重视,其提取工艺是中华民族几千年传承下来的瑰宝,也是中药领域的研究核心[1]。其中,溶剂提取法是应用最广泛的方法之一,它是根据中草药各种有效成分溶解度的性质,将所需活性成分从药材组织内溶解出来的一种提取方法[2]。常用的溶剂提取法有水提法、醇提法、水提醇沉法等,溶剂提取法工艺简单、设备成本低,但也存在提取效率低、有效成分损失较多等缺点。与传统中药提取方法相比,超声波提取技术作为现代提取中药化学成分的一项新技术,具有溶剂用量少、提取效率高、组分损失少等优势,但存在前期资金投入量大、技术理论不够完善等问题[1,3]。中药的提取工艺会直接影响有效成分含量及后期使用效果[4],因此选择合适的提取工艺至关重要。
甘麦大枣汤中以浮小麦为君药,其保健作用及特有的药理特性成为食品领域药食同源的研究热点[5]。对其治疗妇女脏躁症的研究最早出自《金匱要略》[6];袁为玲[7]曾以浮小麦为研究对象,建立硝酸毛果芸香碱小鼠诱汗模型,验证了浮小麦具有显著止汗效果。裴妙荣等[8,9]研究表明,5-烷基间苯二酚(ARs)的同系物5-二十一烷基间苯二酚(ARs-21)具有止汗作用,浮小麦中该成分含量远高于小麦,可作为浮小麦发挥止汗作用的质量控制指标。侯深东等[5]利用响应面法优化了水提甘麦大枣汤的提取工艺,周琴妹等[10]利用水提醇沉法对加味甘麦大枣颗粒提取工艺进行优化,优化后有效成分得率得到一定提升。然而,目前有关浮小麦的研究主要集中在化学成分分析及药效发掘等方面[11,12],对新型浮小麦相关制剂鲜有报道。本研究拟以甘麦大枣汤为研究对象,以ARs-21提取量为主要评价指标,采用超声波提取技术结合水提法、醇提法、水提醇沉法3种溶剂提取法,利用单因素试验及响应面试验优化甘麦大枣汤提取工艺条件,并对不同提取液的理化指标及提取成本进行对比分析,以期为甘麦大枣汤相关新型制剂工业化生产提供理论参考,为中药制剂多样化及浮小麦、甘草、大枣产品的进一步开发利用提供新思路。
1、材料与方法
1.1主要材料与试剂
浮小麦、甘草、大枣,上元堂大药房;N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)-三甲基氯硅烷(TMCS)溶液、乙酸乙酯,均为色谱纯,上海麦克林生化科技有限公司;无水乙醇、NaOH,均为分析纯,天津市天力化学试剂有限公司;Al(NO3)3、NaNO2,均为分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;芦丁(优级纯),北京索莱宝科技有限公司;正十六烷-异辛烷标准溶液,中国计量科学研究院。
1.2主要仪器与设备
Trace 1300型GC/MS联用仪,赛默飞世尔(中国)科技公司;SB-5200DT型超声波清洗机、SCIENTZ-10 N型冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司;DZKW-4型电热恒温水浴锅,北京中兴伟业仪器有限公司;ME104E型电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;WAY-2S型数字阿贝折射仪,上海申光仪器仪表有限公司;EPOCH型酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;NANO S90型纳米粒度仪,英国马尔文仪器有限公司。
1.3实验方法
1.3.1 3种溶剂提取法实验设计
将甘麦大枣汤处方同比例缩小,即浮小麦1.5 g、甘草0.9 g、大枣0.6 g为样品,以ARs-21提取量作为主要评价指标进行实验。
1)水提法响应面试验。
在预试验的基础上,选择3个对ARs-21提取量影响较大的因素,即料液比(A)、煎煮时间(B)、煎煮温度(C)为响应面优化试验中的关键因素,以ARs-21提取量(Y)为响应值进行水提法响应面试验,试验设计因素与水平见表1。称取17份样品,按照表1中料液比加入相应水溶剂,经300 W超声振荡30 min后,进行水提法响应面试验。
2)醇提法响应面试验。
在预试验的基础上,选取乙醇质量浓度(X1)、料液比(X2)、提取时间(X3)为主要因素,以ARs-21提取量(Y)为响应值进行醇提法响应面试验,试验设计因素与水平表见表2。按照表2中料液比加入相应醇溶剂,经过300 W超声振荡30 min后,进行醇提法响应面试验。
3)水提醇沉法单因素试验。
在最佳水提条件下制取水提液,静置冷却至常温后进行醇沉单因素试验设计。
取4份水提液(各20 mL),分别加入体积分数为60%、70%、75%、80%的乙醇,置于冰箱(0~4℃)中进行醇沉,48 h后取出,测定ARs-21及总黄酮提取量,选取适宜的乙醇体积分数。
表1水提法响应面试验设计因素与水平表
表2醇提法响应面试验设计因素与水平表
取4份水提液(各20 mL),加入体积分数为80%的乙醇,置于冰箱(0~4℃)中进行醇沉,分别于12 h、24 h、36 h、48 h后取出,测定ARs-21及总黄酮提取量,选取适宜的醇沉时间。
1.3.2提取液理化指标及物料成本对比分析
分别测定3种提取法最优条件下提取液的纳米粒径、总黄酮提取量和干浸膏得率,结合提取液颜色、状态、透明度、ARs-21提取量及物料成本进行对比分析。
1)ARs-21提取量的测定。
参考黄沁沁等[13]的方法,稍作修改。水提液提取方法:称取一定量的提取液于7500 r/min条件下离心15 min,准确吸取10 mL上清液滴于玻璃平板上,将玻璃平板置于-80℃冰箱中冷冻过夜,随后取出玻璃平板冷冻干燥12 h,即得水提浸膏粉。醇提液提取方法:精确吸取10 mL醇提液于玻璃平板,置于干燥箱中干燥12 h,即得醇提浸膏粉。
衍生化处理:将干燥后的浸膏粉用5 mL乙酸乙酯复溶,转移至离心管后,加入30μL N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺,盖紧瓶盖,涡旋混匀后在60℃条件下水浴30 min,将所得衍生液过0.22μm有机滤膜后,进行GC-MS分析。
GC条件:HP-5毛细管气相色谱柱(30 m×0.25 mm, 0.25μm);载气为He,流量为1 mL/min;升温程序为初始温度150℃,先以20℃/min升温至200℃,再以10℃/min升温至280℃,保持5 min;进样方式为不分流进样;进样口温度为280℃。
MS条件:电子电离源;离子源温度为300℃;扫描范围为35~650 amu。
2)总黄酮提取量的测定。
参考X.C.Li等[14]的方法,稍作修改。准确量取提取液2 mL,加入0.15 mL质量分数为5%的NaNO2溶液,涡旋振荡后静置6 min;加入0.15 mL质量分数为10%的Al(NO3)3溶液,混匀静置6 min;加入2 mL质量分数为4%的NaOH溶液后,用蒸馏水定容至5 mL,混匀静置3 min,测定508 nm处的吸光值,以蒸馏水为空白对照组,芦丁为标准品,绘制标准曲线。
3)干浸膏得率的测定。
将提取液常压浓缩至最小体积,转移至经恒重的蒸发皿中,置于105℃恒温干燥箱中干燥至恒重,即得干浸膏,干浸膏得率计算公式如下:
干浸膏得率=浸膏质量药材质量×100%
4)纳米粒径的测定。
使用纳米粒度分析仪测定3种提取法所得提取液的平均粒径和分布情况,通过Zetasizer Software软件对所得数据进行记录分析。
5)透明度的测定。
折射率是影响物质透明度的重要指标,可以通过调节目标物质折射率来改善其透明度[15,16],因此,可以以折射率为特征值来反映提取液的透明度。在20℃条件下,将提取液滴在阿贝折射仪上,折射仪根据光线透过提取液的折射角来计算折射率并进行分析。
1.4数据处理与分析
每个样品进行3次重复实验,采用Excel 2021对实验数据进行统计分析,利用Design-Expert 12.0对响应面试验设计结果进行分析[17,18,19],采用Origin 2022软件进行制图。
2、结果与分析
2.1 ARs-21测定方法考查
2.1.1仪器精密度分析
取1.3.2中的衍生液,连续进样6次,进样量2μL,以正十六烷为参照峰,计算得其他色谱峰相对保留时间的RSD均小于1%,相对峰面积的RSD均小于2%,说明该仪器精密度良好。
2.1.2重复性实验分析
取1.3.2中的衍生液,每份重复进样3次,以正十六烷为参照峰,计算得共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于0.1%,说明该方法重复性较好。ARs-21测定色谱对比图见图1,其中1为正十六烷,2为ARs-21。
2.2 3种提取法实验优化结果分析
2.2.1水提法响应面试验结果
水提法响应面试验设计与结果见表3。根据表3数据,进行二次回归分析得回归方程:
Y=0.228+0.0312A+0.01B+0.0038C+0.01AB−0.0025AC−0.0628A2−0.0152B2+0.0022C2
对该模型进行显著性检验及方差分析,结果见表4。由表4可知,该模型的P<0.000 1,表明采用水提法所得回归模型极其显著,失拟项P为0.751 0>0.05,表明该模型可以解释响应值的变化,R2与Radj2均大于0.8且数值接近,说明该模型拟合程度较好,变异系数为2.01%<10%,说明实验结果有较高的精确度和可靠性,以上参数均说明该二次多项回归模型可以较好地分析和预测水提法ARs-21的提取量,可以用该模型代替试验真实点对试验结果进行分析。对回归模型显著性分析可知,对ARs-21提取量影响极为显著的因素是A、B、A2及B2,对ARs-21提取量影响显著的因素是C和AB,各因素对ARs-21提取量的影响大小顺序为A>B>C。
图1 ARs-21测定色谱对比图
表3水提法响应面试验设计与结果
图2为水提法响应面试验各因素交互作用图。由图2可看出,AB间交互作用最为显著,而AC间交互作用较为不显著、BC间交互作用最不显著。
表4水提法模型显著性检验及方差分析
由模型预测最佳水提条件为:料液比1∶31.06,提取温度89.99℃,提取时间36.51 min,在此条件下ARs-21提取量为0.239 mg/g。为便于大规模工业生产的可操作性,将最佳水提条件设为料液比1∶31,提取温度90℃,提取时间36 min。在该条件下对水提法模型预测结果进行验证实验,结果表明,ARs-21提取量平均值为0.241 mg/g, RSD为2.59%,与理论最高ARs-21提取量0.239 mg/g相差较小,表明该模型符合统计学要求,预测模型及结果可靠性较高。
2.2.2醇提法响应面试验结果
醇提法响应面试验设计与结果见表5。对17组实验数据进行拟合得回归方程:
Y=0.362+0.04X1−0.0025X2+0.025X3+0.005X1X2−0.005X1X3+0.035X2X3−0.056X12−0.031X22−0.061X32
对该回归模型进行显著性检验及方差分析,结果见表6。由表6可知,该模型的P<0.000 1,表明采用醇提法所得回归模型极其显著。相关系数R2=0.994 5,说明该模型与实际情况拟合良好,失拟项P=0.100 8>0.05,C.V.=2.35%<10%,表明该模型的精确度和可靠性较高。对回归模型显著性分析可知,因素X1、X2、X2X3、X12、X22及X32的P值均<0.000 1,对ARs-21提取量均具有极显著影响,各因素对ARs-21提取量的影响大小依次为X1>X3>X2。图3为醇提法响应面试验各因素交互作用图。结合表6与图3可得出,各因素间X2X3交互作用显著,而X1X2及X1X3之间交互作用不显著。
图2水提法响应面试验各因素交互作用图
表5醇提法响应面试验设计与结果
由该模型预测最佳醇提条件为:乙醇质量浓度502.77 g/L,料液比1∶30.15,提取时间43.05 min,该实验条件下ARs-21提取量为0.371 mg/g。为便于大规模工业生产的可操作性,将最佳醇提条件设为:乙醇质量浓度505 g/L,料液比1∶30,提取时间43 min。在该条件下对醇提法模型进行验证实验。验证实验结果表明,ARs-21提取量平均值0.370 mg/g, RSD为2.66%,与ARs-21最高理论提取量(0.371 mg/g)相差较小,表明该模型符合统计学要求,可靠性较高。
表6醇提法模型显著性检验及方差分析
2.2.3水提醇沉法单因素试验结果
水提醇沉法单因素试验结果见图4。由图4可知,当乙醇体积分数为75%,醇沉时间为48 h时,ARs-21提取量最高。
2.3 3种提取法理化指标对比分析
2.3.1表观评价结果
3种提取液表观评价结果见表7。由表7可知,与水提法提取液相比,醇提法提取液和水提醇沉法提取液的颜色较浅、透明度较高,且黏度较小、流动性较好。实验过程中发现,水提醇沉提取液在醇沉后会产生白色微黄絮状沉淀物,静置至常温,振荡后仍不会溶解。因此,醇提法提取液表观评价结果优于其他两种提取液。
图3醇提法响应面试验各因素交互作用图
2.3.2总黄酮提取量及干浸膏得率结果
实验测得总黄酮提取量标准曲线相关系数R2为0.998 7,说明该模型线性关系良好,实验结果可靠。不同提取方法下总黄酮提取量见图5a)。由图5a)可知,醇提法提取液中总黄酮提取量高于水提法和水提醇沉法提取液,故醇提法总黄酮溶出率更高、提取效果更好。
干浸膏得率是衡量中药提取纯化工艺的重要指标,不同提取方法下干浸膏得率见图5b)。由图5b)可知,水提法干浸膏得率明显高于其他两种方法。
2.3.3纳米粒径分布结果
粒径大小分布对口服液的稳定性、流变性、颜色、外观、保质期等具有重要影响[20,21,22,23]。3种提取液的粒径分布见图6。由图6可知,水提法和水提醇沉法提取液的纳米粒径分布比较相似,纳米粒径均小于水提醇沉法提取液。溶液的布朗运动与其粒径呈负相关关系,粒径越小,布朗运动越强,可使其分布更均匀[24]。此外,与大粒径溶液相比,小粒径溶液具有稳定性好、生物利用度高等优点[25,26]。因此,水提法提取液利于吸收且稳定性更好。
2.3.4工业成本对比分析
ARs是在小麦、黑麦等麦类中发现的一类特殊的酚类类脂,具有两亲性,能够溶于水并将胆固醇、脂肪酸等亲脂性物质包裹其中形成整体,具有多种生理功能[27]。由上述实验可知,与水提法提取液相比,醇提法提取液的ARs-21提取量更高,但是水提法经济成本远低于醇提,乙醇的价格是包装纯净水的5倍,是商业用水的1600倍,按照水提法、醇提法最佳工艺条件进行计算,以1000 g药材为例,采用水提法需31 L水,按照商业用水价格约为0.13元,每次提取36 min,能耗约为6.2元;采用醇提法需要用质量浓度505 g/L的乙醇31 L,约254元,每次提取44 min,能耗约为9.3元,醇提法总成本约是水提法的42倍,但对于ARs-21提取量,醇提法仅约为水提法的1.6倍。
图4水提醇沉法单因素试验结果
表7 3种提取液表观评价结果表
图5不同提取方法下总黄酮提取量及 干浸膏得率图
图6 3种提取液的粒径分布图
3、结论
本文采用超声波提取技术分别结合水提法、醇提法、水提醇沉法3种溶剂提取法,利用单因素试验并结合响应面试验,筛选优化了甘麦大枣汤最佳提取工艺条件,进行了理化指标及提取成本的对比分析。结果表明,醇提法最佳提取条件为料液比1∶30,乙醇质量浓度505 g/L,提取时间43 min,在此条件下提取液颜色、状态良好,ARs-21和总黄酮提取量均较高,但工业生产成本高于水提法;水提法最佳提取条件为料液比1∶31,提取温度90℃,提取时间36 min,在该条件下提取液干浸膏得率较高、纳米粒径较小、生物利用度较高且工业成本低,更适合大规模生产,但同时存在提取液颜色较深、黏度较大的问题;水提醇沉法在醇沉过后会产生白色微黄絮状沉淀,且无法回溶,影响产品品质稳定性,提取效果不佳,不适合甘麦大枣汤的提取。本文研究结果有望为甘麦大枣汤相关制剂的工业化生产提供一定的理论参考,对浮小麦、甘草、大枣精深加工和中药制剂多样化的研究有一定的促进作用。
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基金资助:河南省重大科技专项项目(181100211400-8);
文章来源:董胜男,惠明,田青等.甘麦大枣汤提取工艺对比分析[J].轻工学报,2023,38(04):61-68.
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