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炒僵蚕鉴别方法研究

2024-01-04 46 上传者：管理员

摘要：目的:基于显微鉴别技术、微量升华技术和薄层色谱技术，建立炒僵蚕饮片的鉴别方法。方法:依据显微鉴别法，对炒僵蚕粉末的显微特征进行描述；采用微量升华法，对炒僵蚕升华物结晶状态进行描述；采用薄层色谱法，僵蚕对照药材和伪品为对照，对炒僵蚕进行薄层色谱鉴别。结果:炒僵蚕粉末呈黄褐色，在显微镜下清晰可见菌丝体、体壁碎片、刚毛、未消化的桑叶组织、草酸钙簇晶、草酸钙方晶及导管等结构，与僵蚕对照药材类似；炒僵蚕的升华物呈霜花状、羽状结晶，与僵蚕对照药材类似；TLC图中，斑点清晰、专属性好。结论:该方法快速、易操作、专属性好，可作为炒僵蚕饮片的鉴别方法，并为提高鉴别标准提供参考。

关键词：
僵蚕
微量升华技术
显微鉴别技术
炒僵蚕
薄层色谱鉴别技术
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炒僵蚕是僵蚕药材的麸炒加工品，而僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus 4～5龄幼虫感染(或人工接种)白僵菌Beauveria bassiana (Bals.)-Vuillant而致死的干燥体。僵蚕始载于《神农本草经》,列为中品，其后诸家本草均有记载[1,2];具有祛风解痉、活血通络、化痰散结之功效，用于肝风夹痰、惊痫抽搐、小儿急惊、破伤风、风热头痛、目赤咽痛、风疹瘙痒等[3,4,5,6,7],目前临床使用多为炒僵蚕。

本研究通过对僵蚕药材及饮片市场进行调研，发现僵蚕药材及饮片掺杂和掺伪现象十分普遍，即便是多年的老药工也难以辨别。如果将伪品僵蚕通过麸炒，炮制成炒僵蚕，其性状与正品炒制成品一致，更难以区分。《中华人民共和国药典》2020版一部“炒僵蚕”项下收载的鉴别方法仅为性状鉴别，鉴别方法单一。因此，本研究选择僵蚕正品和伪品作为对照，依据炒僵蚕的显微特征、升华物及薄层色谱特性，建立炒僵蚕的鉴别方法，为炒僵蚕的临床使用及质量标准提升提供参考。

1、仪器与材料

BX51型显微镜(日本奥利巴斯),电子天平(北京赛多利斯仪器天平有限公司),半自动点样仪(瑞士卡玛),高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);石油醚(60～90 ℃)、丙酮、正丁醇、冰醋酸和水合氯醛均为分析纯，水为超纯水；硅胶G薄层层析版(青岛海洋化工有限公司)。

实验用僵蚕药材购自安国药材市场，其来源为大别山区，经马晓静副主任药师鉴定为正品僵蚕药材，本研究以此样品作为僵蚕对照药材使用；通过药材市场购进一批伪品僵蚕，经研究鉴定，为水晶蚕，在本研究中作为伪品使用。其他炒僵蚕信息，见表1。

表1 炒僵蚕饮片信息

2、方法与结果

2.1 显微鉴别

2.1.1 僵蚕对照药材

取僵蚕粉末适量，呈灰棕色，水合氯醛试液装片，置显微镜下观察，菌丝体细长，无色，卷曲于体壁碎片中。气管碎片可见，多具深棕色或棕褐色的螺旋丝，略弯曲。表皮组织表面多皱缩，具纹理突起，形成小尖突，有圆形毛窝，黄色；刚毛，壁稍厚，黄色，表面光滑。未消化的桑枝组织中可见明显的草酸簇晶或方晶，导管少见。另取5 g完整僵蚕，加水10 mL,强烈振摇1 min, 取混悬液，离心(转速为5 000 r/min)3 min, 取沉淀物，加甘油醋酸试液2 mL,摇匀，取混悬液1滴，置显微镜下，可分检出白僵菌分生孢子，众多，白色，球形至卵形，直径2.5～4.5 μm。气生菌丝细长，多缠绕或呈束。体壁碎片及刚毛可见。

2.1.2 炒僵蚕

炒僵蚕粉末呈黄褐色，其他显微特征同僵蚕对照药材。

2.1.3 伪品僵蚕

粉末呈黄褐色，同法操作，可见体壁碎片，气管碎片，刚毛、桑叶组织同对照药材，体壁碎片中未见菌丝体，未见分生孢子和气生菌丝。见图1和图2。

2.2 升华物鉴别

2.2.1 僵蚕对照药材

取石棉网置酒精灯上，在石棉网上放置一高度约1 cm的铁环(或顶针),再取僵蚕对照药材粉末适量，填满铁环约一半的量，点燃酒精灯进行微量升华，取载玻片置铁环上，每30 s更换1次载玻片，直至冒棕黄色烟为止，收集升华物，置显微镜下观察升华物结晶，呈霜花状或羽状。

图1 僵蚕显微特征(×200)

图2 僵蚕中白僵菌显微特征。

2.2.2 炒僵蚕

取炒僵蚕同法试验，升华物结晶同僵蚕对照药材。

2.2.3 伪品僵蚕

无升华物产生，产生大量油滴，见图3。

图3 僵蚕及伪品升华物鉴别显微结构(×100)

2.3 薄层色谱鉴别

2.3.1 薄层色谱鉴别

取炒僵蚕粉末1 g, 加入10 mL甲醇超声30 min, 离心取上清液，回收溶剂浓缩至约5 mL,作为供试品溶液；另取僵蚕对照药材和伪品各1 g, 同法制备，得僵蚕对照药材溶液和伪品对照溶液。照薄层色谱法，吸取上述两种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(7∶1)为展开剂，置双槽展开缸中，展开，取出，挥干溶剂，置紫外灯(365 nm)下检查。供试品色谱中，在僵蚕对照药材色谱相同位置处，应检出2～3个红色斑点和1个亮蓝色斑点。炒僵蚕色谱中，在对照品药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而伪品完全不同于对照药材。结果见图4。

图4 僵蚕薄层色谱鉴别

3、讨论

3.1 显微鉴别

炒僵蚕经过麸炒后，其粉末显微特征气管碎片、刚毛、未消化的桑叶组织和菌丝体等特征未发生变化，特征明显，易观察，而桑叶组织中的导管相对较难以观察。与伪品相比较，伪品中除菌丝体外，其他均与对照药材相同，故显微特征中菌丝体为鉴别要点，有很多僵蚕未经白僵菌感染[8,9],因此，其生品和炒制品中均不会检视到卷曲缠结于体壁中的细长无色菌丝体。

僵蚕实则为真菌与家蚕的复合体，本研究针对附于体表的白色粉霜状物进行了显微鉴别，此部分主要为白僵菌的显微特征。与伪品比较，僵蚕经过了白僵菌感染，无分生孢子和气生菌丝特征。而炒僵蚕，在麸炒过程中同样会损耗一部分，通过水冲刷提取，僵蚕表皮中残留的分生孢子及气生菌丝也可被提取出来，且特征同对照药材，此部分也为鉴别要点。

3.2 升华物鉴别

本研究将炒僵蚕与生品进行对比，经过炒制之后，微量升华得到的晶体与生药材一致。典型的霜花状结晶居多，羽状结晶较少[10,11]。在刚刚接收初期，多半为水和细小晶体，收集中后期，升华物增加，多包埋于油滴中，且出现晶核，后期多为油烟，升华物较少，晶核较多。而伪品无升华物产生，可见僵蚕中升华物鉴别与家蚕是否感染白僵菌相关。

3.3 薄层色谱鉴别

本研究通过薄层色谱鉴别分别考察了硅胶G、硅胶H薄层板，发现硅胶G板略优于H板，并且分别考察了10%硫酸乙醇、5%的香草醛硫酸溶液和1%三氯化铝乙醇溶液显色，结果显示在365nm紫外灯下检视效果最佳[12,13,14]。通过图4可知，与生药材相比，炒制后对红色荧光斑点的个数有一定影响，而伪品在此条件下完全无斑点。

4、结语

综上所述，本研究报道的显微鉴别中体壁碎片中菌丝体、分生孢子和菌丝体特征，升华鉴别和薄层色谱鉴别均与对照药材一致；与伪品相比，所建立的鉴别方法专属性高，能有效判定炒僵蚕投料样品的真实状况。本研究为改进炒僵蚕的鉴别方法提供了参考。

参考文献:

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[3]权浩浩,张晓凤,高凯,等.基于网络药理学的僵蚕主要药效作用研究[J].西部中医药,2021,34(3):92-96.

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