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DCLRE1A调控线粒体生物发生在年龄相关性白内障发生发展中的作用

2025-09-06 26 上传者：管理员

摘要：目的探究DNA交联修复1A(DCLRE1A)对晶状体上皮细胞(LECs)中线粒体功能的影响｡方法选择30例30眼年龄相关性白内障(ARC)患者,分为ARC皮质型(ARCC组)､ARC核型(ARNC组)､ARC后囊下型(ARPC组),每组各10例｡同时选择同期我院就诊的10例10眼年龄匹配的诊断为黄斑前膜的透明晶状体患者为对照组｡Westernblot检测各组患者前囊膜组织中以及体外经过氧化氢(H2O2)处理的晶状体上皮细胞株(SRA01/04)氧化损伤模型和过表达DCLRE1A模型(OE-DCLRE1A组)中DCLRE1A蛋白表达水平,检测过表达DCLRE1A对线粒体转录因子(TFAM)和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC1α)蛋白表达水平的影响｡将正常培养的SRA01/04细胞随机分为Control组(未经任何处理)､H2O2组､H2O2+HA组(转染对照质粒HA)､H2O2+OE-DCLRE1A组(转染质粒DCLRE1A),RT-PCR测定各组细胞mtDNA表达,免疫荧光染色法检测各组细胞线粒体膜电位(MMP)和线粒体活性氧(ROS)的变化｡结果Westernblot检测结果显示,与对照组相比,ARCC组､ARNC组､ARPC组患者晶状体前囊膜组织中DCLRE1A蛋白相对表达水平均下降,差异均有统计学意义(均为P<0.001)｡体外诱导的H2O2细胞氧化损伤模型中,与Control组相比,H2O2组细胞中DCLRE1A蛋白相对表达水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.001)｡DCLRE1A过表达效率结果显示,与Control组相比,OE-DCLRE1A组细胞中DCLRE1A蛋白相对表达水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.001)｡RT-PCR检测结果显示,与H2O2+HA组相比,H2O2+OE-DCLRE1A组细胞中mtDNA表达水平明显上升,差异有统计学意义(P<0.001)｡Westernblot检测结果显示,与H2O2+HA组相比,H2O2+OE-DCLRE1A组细胞中TFAM和PGC1α蛋白相对表达水平均明显上升,差异均有统计学意义(均为P<0.001)｡免疫荧光染色结果显示,与H2O2+HA组相比,H2O2+OE-DCLRE1A组细胞中MMP水平明显恢复,线粒体ROS累积减少,差异均有统计学意义(均为P<0.001)｡结论在H2O2诱导的氧化应激条件下,DCLRE1A通过调控线粒体生物发生促进LECs内损伤性mtDNA的修复,从而减少LECs凋亡,参与ARC的发生发展｡

关键词：
DNA交联修复基因
年龄相关性白内障
晶状体上皮细胞
线粒体DNA损伤修复
视力损害
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年龄相关性白内障(ARC)以混浊晶状体取代透明晶状体为特征,是老年人致盲和视力损害的重要原因[1]｡活性氧(ROS)导致DNA特别是线粒体DNA(mtDNA)氧化损伤是ARC发病的主要因素[2-4]｡目前多项研究证明,DNA交联修复1A(DCLRE1A)可以改善DNA的复制和转录,在多种DNA损伤修复过程中发挥作用[5-7]｡然而,其在mtDNA损伤修复中的作用机制目前仍不清楚｡本研究中,利用过氧化氢(H2O2)构建细胞氧化损伤模型,探究DCLRE1A对晶状体上皮细胞(LECs)内损伤性mtDNA修复的影响,为ARC的防治理论提供依据｡

1、材料与方法

1.1一般资料与分组

收集南通大学附属医院眼科就诊的患者(年龄50~80岁)｡根据晶状体混浊分类系统(LOCSIII)随机选择30例30眼ARC患者,其中10例ARC皮质型(ARCC组)､10例ARC核型(ARNC组)､10例ARC后囊下型(ARPC组),同时选择同期我院就诊的10例10眼年龄匹配诊断为黄斑前膜疾病的透明晶状体患者为对照组｡排除高血压､糖尿病､高度近视､青光眼､葡萄膜炎等其他眼部疾病或全身性疾病患者｡ARC组患者年龄(67.00±2.49)岁,对照组患者年龄(65.00±3.19)岁,差异无统计学意义(P>0.05)｡在白内障手术中,采用前连续曲线撕囊术收集晶状体前囊膜｡本研究获得了南通大学附属医院医学伦理委员会的批准(批号:2021-L091),并遵循《赫尔辛基宣言》的原则｡我们向所有参与者解释了实验的目的､程序和潜在风险,所有患者均签署了知情同意书｡1.2材料

SRA01/04细胞系(中国科学院细胞库)｡DMEM培养基和胎牛血清(美国赛默飞公司),10ｇ·Ｌ－１链霉素和１０ｇ·Ｌ－１青霉素（苏州新赛美有限公司),细胞培养皿(美国NEST生物公司),过表达质粒和对照质粒(中国吉凯生物有限公司),HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)､HRP标记山羊抗鼠IgG(H+L)､DCLRE1A､线粒体转录因子(TFAM)､过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PGC1α)､β-actin抗体(武汉三鹰生物有限公司),线粒体膜电位(MMP)试剂盒､线粒体ROS检测试剂盒(日本同仁有限公司)｡

1.3细胞培养和细胞转染

快速将细胞从液氮中取出,37℃水浴锅进行解冻后加入加有完全培养基(青链霉素双抗:胎牛血清:DMEM=1:20:80)的培养瓶中,充分混匀,将其放置在37℃､含有体积分数5%二氧化碳细胞培养箱中培养｡后续细胞长满后进行消化传代,接种到培养皿中进行相应的处理｡根据前期研究[8],我们选取400μmol·L-1H2O2在体外制作细胞氧化损伤模型和细胞DCLRE1A过表达模型｡将pcDNA3.1-DCLRE1A和空白载体用Lipo8000脂质体按照说明书转染到SRA01/04细胞中,孵育72h后提取蛋白用于后续实验｡

1.4Westernblot检测患者晶状体前囊膜组织和细胞样本的蛋白表达

收集ARC患者和对照组患者的前囊膜组织样本和处理好的各组SRA01/04细胞,PBS清洗2次后吸干剩余水分,加入蛋白裂解液提取总蛋白,置于4℃摇床上裂解30min,使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度｡然后,等量的蛋白质样品通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移到聚偏二氟乙烯膜上,转移后用50g·L-1脱脂牛奶室温封闭2h｡按照抗体说明书稀释抗体DCLRE1A(1:1000)､TFAM(1:1000)､PGC1α(1:500)､β-actin(1:1000),在4℃下孵育过夜,TBST洗3次｡最后,再次将膜与二抗在室温下孵育2h,随后置于暗室内曝光显影,并使用ImageJ定量蛋白的相对表达水平｡

1.5检测DCLRE1A干预后的SRA01/04细胞中mtDNA含量

将稳定生长的SRA01/04细胞接种在96孔培养皿中,24h后,根据实验分为Control组(未经任何处理)､H2O2组(400μmol·L-1H2O2处理)､H2O2+HA组(转染质粒HA,同时400μmol·L-1H2O2处理)､H2O2+OE-DCLRE1A组(转染质粒DCLRE1A,同时400μmol·L-1H2O2处理),分别处理SRA01/04细胞｡转染72h后,使用TIANamp基因组DNA试剂盒从SRA01/04细胞中提取基因组DNA｡使用线粒体18SrRNA基因､mtDNA基因的引物,通过RT-PCR测定各组细胞中mtDNA相对表达水平｡引物序列:18SrRNA正向引物为5’-GCTTTCTACCTACATGGTTGATC-3’,反向引物为5’-GGCCTCGAAAGAGTCCTGTA-3’;mtDNA正向引物为5’-CACCCAAGAACAGGGTTTGT-3’,mtDNA反向引物为5’-TGGCCATGGGTATGTTGTTAA-3’｡

1.6MMP和线粒体ROS水平检测

将细胞接种在共聚焦皿中,按1.5中分组方法处理24h｡根据线粒体膜电位检测试剂盒和线粒体ROS检测试剂盒说明书进行操作,使用JC-1作为荧光探针快速检测SRA01/04细胞中的MMP｡通过荧光显微镜拍摄观察,使用ImageJ定量分析｡

1.7统计学方法

采用SPSS22.0统计学软件对数据进行分析｡所有数据均以均数±标准差表示,组间比较采用两样本t检验｡检验水准:α=0.05｡

2、结果

2.1各组患者晶状体前囊膜组织中DCLRE1A的表达

Westernblot检测结果显示,与对照组(1.00±0.12)相比,ARCC组､ARNC组､ARPC组患者晶状体前囊膜组织中DCLRE1A蛋白相对表达水平(0.68±0.08､0.58±0.04､0.49±0.05)均明显下降,差异均有统计学意义(均为P<0.001)(图1)｡

图1Westernblot检测各组患者晶状体前囊膜组织中DCLRE1A蛋白表达

2.2H2O2处理后SRA01/04细胞中DCLRE1A的表达

Westernblot检测结果显示,Control组和H2O2组SRA01/04细胞中DCLRE1A蛋白相对表达水平分别为1.00±0.08､0.48±0.11｡与Control组相比,H2O2组细胞中DCLRE1A蛋白相对表达水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.001)(图2)｡

图2Westernblot检测H2O2处理的细胞氧化损伤模型中DCLRE1A蛋白表达变化

2.3DCLRE1A过表达模型验证

Westernblot检测结果显示,与Control组(1.00±0.13)相比,OE-DCLRE1A组SRA01/04细

显增加,差异有统计学意义(P<0.001)(图3),说明过表达DCLRE1A的模型构建成功｡

图3Westernblot检测SRA01/04细胞中过表达DCLRE1A质粒转染的效率验证

2.4过表达DCLRE1A对线粒体生物发生的影响

RT-PCR检测结果显示,Control组､H2O2组､H2O2+HA组､H2O2+OE-DCLRE1A组SRA01/04细胞中mtDNA相对表达水平分别为1.00±0.12､0.62±0.09､0.60±0.16､0.81±0.15｡与Control组相比,H2O2组细胞中mtDNA相对表达水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.001);与H2O2+HA组相比,H2O2+OE-DCLRE1A组细胞中mtDNA相对表达水平明显上升,差异有统计学意义(P<0.001)｡Westernblot检测结果显示,Control组､H2O2组､H2O2+HA组､H2O2+OE-DCLRE1A组SRA01/04细胞中TFAM蛋白相对表达水平分别为1.00±0.02､0.56±0.04､0.64±0.04､0.84±0.03,PGC1α蛋白相对表达水平分别为0.98±0.07､0.69±0.06､0.64±0.05､0.80±0.05｡与Control组相比,H2O2组细胞中TFAM和PGC1α蛋白相对表达水平均下降,差异均有统计学意义(均为P<0.001);与H2O2+HA组相比,H2O2+OE-DCLRE1A组细胞中TFAM和PGC1α蛋白相对表达水平均明显上升,差异均有统计学意义(均为P<0.001)(图4)｡

图4过表达DCLRE1A对线粒体生物发生蛋白表达的影响

2.5过表达DCLRE1A对MMP和线粒体ROS水平的影响

免疫荧光染色结果显示,Control组､H2O2组､H2O2+HA组､H2O2+OE-DCLRE1A组SRA01/04细胞中MMP荧光强度相对表达水平分别为1.00±0.03､1.56±0.08､1.47±0.10､1.10±0.09,线粒体ROS荧光强度相对表达水平分别为1.00±0.04､4.20±0.07､5.01±0.05､1.05±0.03｡与Control组相比,H2O2组细胞中MMP相对表达水平显著上升,线粒体ROS累积(均为P<0.001);与H2O2+HA组相比,H2O2+OE-DCLRE1A组细胞中MMP水平得到恢复,线粒体中ROS累积减少(均为P<0.001)(图5)｡A:Control组;B:H2O2组;C:H2O2+HA组;D:H2O2+OE-DCLRE1A组｡

图5过表达DCLRE1A对MMP和线粒体ROS水平的影响

3、讨论

研究表明,DNA氧化损伤在ARC的病因学中起着关键作用[9-11]｡积累的损伤性DNA会激活不同的DNA修复途径[12]｡本课题组前期研究发现,切除修复交叉互补基因6基因在核苷酸切除修复中发挥关键作用[13];8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1基因在碱基切除修复途径发挥重要作用[14]｡DCLRE1A通过结合多种修复因子发挥DNA修复作用[7]｡前期研究发现,DCLRE1A在ARC患者和H2O2处理的细胞中的表达显著降低[8,15]｡然而,其具体调控机制尚未完全清楚｡

随着晶状体老化,DNA氧化损伤修复系统逐渐破坏,累积的ROS诱导线粒体功能障碍,引起LECs功能丧失而形成ARC[16-18]｡当线粒体受损时会发生一些形态和功能变化,主要包括线粒体自噬､线粒体融合/裂变､线粒体生物发生,来清除受损线粒体维护线粒体动态平衡[19-22]｡由于mtDNA缺乏组蛋白保护,特别容易受到氧化损伤,在白内障患者中,发现mtDNA损伤程度比核DNA更高,表明其在白内障的发病机制中起着重要作用[2,18,23-24]｡另外,有研究报道,在高氧诱导的大鼠晶状体中发现mtDNA损伤､线粒体DNA碱基切除修复酶的表达和DNA糖苷酶1基因的水平显著升高[3],并且随着年龄的增加,mtDNA损伤累积,产生更多的ROS,导致氧化应激的“恶性循环”[4]｡综上,白内障的氧化应激和mtDNA损伤密切相关｡本研究通过RT-PCR检测mtDNA发现,在H2O2诱导的氧化损伤模型中,mtDNA明显下降,表明H2O2导致mtDNA损伤,而DCLRE1A的过度表达可以部分恢复mtDNA损伤,并且促进氧化损伤环境下TFAM和PGC1α蛋白的表达,表明DCLRE1A可以促进mtDNA复制以及线粒体生物发生｡

线粒体生物发生是一个自我更新的过程,通过合成新的线粒体来维护mtDNA,从而维持机体内环境的稳态,是线粒体损伤修复的重要步骤[25-26]｡多项研究表明,线粒体生物发生可以通过恢复线粒体功能减少细胞凋亡[27-29]｡在年龄相关性黄斑变性中发现,SHP-1敲低通过抑制线粒体生物发生,加剧了STING/AMPK途径诱导的线粒体依赖性细胞凋亡[27]｡在糖尿病心肌病中,SFRP2通过以AMPKPGC1α依赖性方式挽救线粒体功能发挥心脏保护作用,调节线粒体动力学和线粒体生物合成,减少氧化应激和细胞凋亡[29]｡因此,我们继续探讨DCLRE1A对线粒体功能的影响,猜测其是否可以通过影响线粒体功能来改善LECs的凋亡｡本研究通过检测MMP和线粒体ROS发现,过表达DCLRE1A可以缓解氧化损伤环境下导致的线粒体功能下降｡我们前期研究发现,DCLRE1A表达升高可增强LECs活力,促进受损DNA修复,最终抑制细胞凋亡[8]｡本文更深入探讨了DNA修复的具体机制,发现其可以通过调控线粒体生物发生来影响线粒体功能,进而减少LECs凋亡｡

4、结论

DCLRE1A在3种类型的ARC患者LECs和H2O2诱导的SRA01/04细胞中表达下降｡DCLRE1A表达升高可通过线粒体生物发生促进mtDNA损伤修复,最终抑制线粒体功能障碍诱发的细胞凋亡｡本研究为进一步探索ARC的发病机制和治疗靶点奠定了基础｡

基金资助:国家自然科学基金项目(编号:81974129,82171038);

文章来源:孙诚浩,吴苗苗,李鹏飞,等.DCLRE1A调控线粒体生物发生在年龄相关性白内障发生发展中的作用[J].眼科新进展,2025,45(09):679-683.