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体外实验验证槲皮素治疗后发性白内障的作用机制

2024-05-29 136 上传者：管理员

摘要：目的通过分子对接技术验证核心成分与核心靶点的结合能，体外实验验证槲皮素(QUE)对TGF-β2诱导的人晶状体上皮细胞(HLE-B3)的作用。方法前期通过网络药理学的方法筛选出丹红化瘀口服液(DHK)治疗后发性白内障(PCO)的核心成分槲皮素(QUE),关键靶点STAT3、JUN、TNF、TGF-β、IL-6、AKT1,利用AutoDock等软件获取核心成分与关键靶点的结合能，通过CCK-8、细胞划痕、RT-qPCR及Western blot等体外实验验证QUE对TGF-β2诱导的HLE-B3的作用。结果 QUE与关键靶点STAT3、JUN、TNF、TGF-β、IL-6、AKT1有很好的结合性；体外实验结果表明QUE对TGF-β2诱导的HLE-B3细胞增殖起到抑制作用，且抑制作用呈浓度依赖性；QUE通过上调Bax和下调Bcl-2蛋白表达，发挥治疗PCO的作用。结论 QUE可通过多靶点和多通路发挥治疗PCO的作用，为临床治疗提供参考。

关键词：
PCO
丹红化瘀口服液
后发性白内障
槲皮素
网络药理学
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白内障在全球致盲眼病中占首位，后发性白内障(posterior capsule opacification, PCO)是白内障术后常见的并发症[1]。据有关文献报道，成人在接受白内障术后治疗后2年内，有20%～30%的患者因PCO再次出现视力明显下降[2],35%的患者在5年内因发生PCO需要再次干预。在儿童白内障中，由于晶状体上皮细胞(Lens epithelial cells, LECs)增生活跃，发病率接近100%[3]。PCO的发病机制可能与术后残留在晶体前囊膜和赤道部LECs发生增殖、迁移、上皮间充质转化(EMT)有关[4]。目前临床上治疗PCO方法主要有再次手术和YAG激光治疗，再次手术对术眼有损伤，手术费用高，患者心理压力大。使用YAG激光治疗后，除了会导致囊袋稳定性下降、人工晶体偏位，还存在眼压升高、视网膜脱离、黄斑囊样水肿等[5]并发症。随着临床上改良手术和新型人工晶体的应用，PCO的发生率相比之前有所下降，但远期效果仍不太理想。而天然药物以其较低的毒副作用、安全性高等特点，已经成为药物防治PCO的研究热点[6]。

丹红化瘀口服液(Danhong Huayu oral liquid, DHK)是一种有效的中药制剂，主要用于治疗气滞血瘀所致的视力模糊、视网膜中央静脉闭塞的吸收期[7,8],由于DHK复方剂成分复杂，给后面的提取增加了难度，所以临床应用也受到限制。本课题初期就基于网络药理学的研究方法，筛选出DHK治疗PCO的核心成分槲皮素(quercetin, QUE)。QUE是一种黄酮类药物，广泛存在植物中。本课题以TGF-β2作为诱导PCO体外细胞模型，分析QUE对TGF-β2诱导的HLE-B3细胞的作用。由于QUE治疗PCO相关文献报道尚少，具体的作用机制尚未明确，本课题对临床应用具有十分重要的意义。

分子对接是通过受体的特征以及受体和药物分子间相互作用的方式来进行药物设计，并预测其亲和力和结合模式的理论模拟方法[9]。近年来，分子对接方法已成为一项重要技术[10]。本课题采用分子对接技术及体外实验探讨QUE治疗PCO的作用机制。

1、材料与方法

1.1 材料

槲皮素(南京道斯夫生物科技有限公司，纯度98%,货号：22061811),溶于DMSO溶液中，配制成40mmol/L母液，用无菌微孔滤膜过滤除菌后放-20℃保存备用。MEM培养基(普诺赛，货号：PM150410);胎牛血清(CellMax, 货号：SA311.02);胰蛋白酶(无EDTA)、青霉素-链霉素溶液(biosharp, 货号：BL527A、BL505A);CCK-8试剂、BCA试剂盒(biosharp, 货号：BS350B、BL521A);Hoechst 33342染色液(碧云天，货号：C1025);TUNEL试剂盒(碧云天，货号：C1086);荧光定量PCR试剂盒(ABclonal, 货号：RK20429、RK21203);一抗：BAX、BCL-2、α-SMA、E-cadherin、β-Tubulin(ABclonal, 货号分别为：A15646、A0208、A1011、A20798、A12289);兔二抗(ABclona, 货号：AS014)。

倒置荧光显微镜(日本Olympus公司);全自动酶标仪(美国Bio-Tek公司);化学凝胶成像系统(英国Syngene公司);二氧化碳培养箱(美国Eppendorf公司);高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);Milli-Q Synthesis超纯水系统(美国Millipore公司)。

人晶状体上皮细胞系HLE-B3购自宁波明舟生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分子对接技术

在PubChem数据库中搜索核心成分的2D结构下载和优化，关键靶点导入PDB并下载PDB Format格式，利用Pymol和Autodocktools等软件去除水分子及小分子配体和进行对接验证，并分析其活性。亲和力值<-5kcal/mol(1kcal≈4.186kJ),有结合活性，结合亲和力值 <-7.0kcal/mol, 表明该化合物与蛋白质之间具有很好地结合活性。

1.2.2 细胞培养

人晶状体上皮细胞系HLE-B3,置于37℃、5.0% CO2 培养箱培养，细胞株用含10%胎牛血清MEM培养基，当细胞密度铺满约90%培养皿底时，采用0.25%胰酶消化后进行传代。

1.2.3 CCK-8法检测药物对细胞活力影响

(1)体外PCO细胞模型的建立：

细胞随机分为空白组、对照组和TGF-β2模型组(浓度分别为1、5、10、15、20ng/mL),各组设置6个复孔。取对数生长期HLE-B3细胞，以1×104孔密度的细胞悬液铺在96孔板中，每孔100μL,按实验分组给药，每孔加入含10%CCK-8溶液的培养基，使用酶标仪测定450nm处的OD。

(2)QUE对HLE-B3细胞活力检测：

将对数生长期HLE-B3细胞接种96孔板，按照空白组、对照组和QUE组(10、20、40、80、100、160μmol/L)进行给药，加10%CCK-8溶液的培养基，酶标仪测定OD值。

(3)QUE对TGF-β2诱导的HLE-B3细胞增殖影响：

由上述(1)(2)可知，当10ng/mL TGF-β2可以成功建立PCO的体外细胞模型，QUE在浓度20～160μmol/L对HLE-B3细胞呈浓度相关性抑制。因此，本实验按对照组、TGF-β2(10ng/mL)、TGF-β2+QUE组(20、40、60、80、100、120μmol/L)分组。按实验各组给药，每孔加入含10%CCK-8溶液的培养基，酶标仪测定OD值。

1.2.4 细胞划痕检测细胞迁移能力

在6孔板背面用marker笔均匀划横线，以1×105孔细胞浓度接种细胞，过夜后单层细胞达到80%左右予TGF-β2刺激，第二日用直尺固定加样枪头，去除划下的细胞，按上述1.2.3(3)实验分组进行给药。分别于0、24h观察拍照，使用ImageJ软件分析图片，每张图片选取3个水平线计算细胞间的迁移率。

1.2.5 RT-qPCR法检测相关mRNA表达水平

按照Trizol试剂说明书提取实验组和对照组的细胞内总RNA,按照cDNA和qPCR试剂盒说明书进行逆转录和qPCR体系反应。以2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。引物序列如表1。

表1 引物序列表

1.2.6 Western blot检测相关蛋白的表达量

细胞接种至6孔板，按上述分组进行处理后，收集细胞，按照BCA蛋白定量试剂盒说明书检测，使用SDS-PAGE进行蛋白凝胶电泳，湿法转膜、快速封闭，一抗4℃摇床孵育过夜，二抗孵育TBST同样洗膜，使用ECL法显影，利用ImageJ进行蛋白条带灰度值分析。

1.3 统计学方法

上述实验重复3次，实验数据采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，两组之间的差异采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有显著性意义。

2、结果

2.1 分子对接结果

分子对接结果显示核心成分中只有QUE与六个关键靶点结合活性更好，对接具体结合能值如表2,分子对接热图如图1。

表2 核心成分与关键靶点结合能信息(kJ/mol)

图1 分子对接图

2.2 CCK-8检测HLE-B3增殖

结果表明：当TGF-β2浓度为1ng/mL时，与对照组差异无统计学意义；当浓度为10ng/mL时，细胞活力最强，和对照组相比，差异有明显统计学意义(图2)。

图2 CCK-8检测细胞活力

2.3 Western blot检测HLE-B3细胞相关蛋白的表达情况

实验结果显示，随着TGF-β2浓度增高，α-SMA蛋白表达量逐渐上调，当TGF-β2为10ng/mL时，蛋白表达量最多，与对照组相比，有明显的统计学意义(P<0.01),而之后随着TGF-β2的浓度增加，蛋白表达反而逐渐下调；与对照组相比，随着TGF-β2的浓度增高，E-cadherin蛋白表达逐渐下调(图3)。故后期实验用浓度为10ng/mL的TGF-β2作为PCO体外细胞模型，这也与相关文献报道吻合[11]。

图3 不同浓度的TGF-β2诱导HLE-B3细胞相关蛋白的表达

2.4 CCK-8检测QUE对HLE-B3细胞活力影响

当QUE浓度为10μmol/L时，促进细胞增殖，之后并以浓度依赖性方式抑制细胞活性，且和对照组相比，差异均有统计学意义(如图4A);当QUE浓度为20～120μmol/L时，对TGF-β2诱导的HLE-B3细胞呈浓度相关性抑制，均有统计学意义(如图4B)。故采用20、60、100μmol/L QUE浓度用于后期实验。

图4 CCK-8检测细胞活力

2.5 QUE对HLE-B3细胞迁移能力影响

如图5A所示，与对照组相比，在0h时各组差异无统计学意义；如图5B所示，在24h时TGF-β2组迁移能力最强，随着QUE浓度增高，迁移能力显著降低，T+Q20与TGF-β2相比无统计意义，T+Q60、T+Q100与TGF-β2相比均有统计学意义。

图5 QUE对TGF-β2诱导的HLEB-3细胞的迁移作用

2.6 RT-qPCR检测HLE-B3细胞相关α-SMAmRNA、E-cadherin mRNA的表达水平

与对照组相比，TGF-β2组α-SMA mRNA表达明显增多。与TGF-β2组相比，随着QUE浓度的增高，α-SMA mRNA表达逐渐减少，但高于对照组；与对照组相比，TGF-β2组E-cadherin mRNA表达显著降低。与TGF-β2组相比，随着QUE浓度的增高，E-cadherin mRNA表达逐渐增多，但低于对照组(如图6)。

图6 QUE对TGF-β2诱导的HLE-B3细胞相关mRNA的表达。

2.7 QUE对HLE-B3细胞α-SMA、E-cadherin及相关凋亡蛋白的影响

实验结果显示，与对照组相比，QUE可上调TGF-β2诱导的HLE-B3细胞中Bax蛋白表达，同时下调 Bcl-2蛋白表达(如图7A、7B)。与TGF-β2相比，QUE可下调TGF-β2诱导的HLE-B3细胞中α-SMA蛋白表达，且呈浓度相关性；同时上调E-cadherin蛋白表达(如图7C、7D);

图7 QUE对TFG-β2诱导的HLE-B3细胞相关蛋白表达的影响

3、讨论

据美国卫生与公众服务部(HHS)的数据结果显示，人类平均每日摄入QUE约为25mg[12]。QUE是一种天然的抗氧化剂，已被报道具有广泛的生物学作用，包括抗氧化、抗癌、抗纤维化等。文献[13,14,15]报道TGF-β是一种被广泛研究的多肽生长因子，可以调节细胞生长分化、凋亡、免疫的多种蛋白质，能够强效诱导晶状体上皮细胞转化为成纤维细胞进而发挥迁移作用。在哺乳动物中发现TGF-β有1、2、3三种亚型，其中TGF-β2在人晶状体和眼中膜中均有高度表达，并调节PCO中LECs增殖、迁移和在EMT中发挥关键作用。

晶状体外形如一个透明而又小的圆盘，在人眼睛中，它可聚集光线，使我们能够清晰的看到物体，而晶状体上皮细胞主要负责调节晶状体的生理平衡，包括电解质和液体的输送。晶状体浑浊易发生白内障，白内障是世界上最常见的致盲原因。HE等[16]研究证实QUE可通过抑制高糖培养的人晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞中PI3K/Akt/mTOR信号的激活，这表明QUE可能对糖尿病性白内障的早期发展具有预防和抑制作用。本实验通过前期网络药理学预测DHK和PCO的核心成分QUE和关键靶点TGF-β,基于此，通过分子对接验证了QUE和TGF-β有很好的结合性。体外实验以TGF-β2诱导HLE-B3细胞，建立PCO体外模型，并检测上皮标志蛋E-cadherin, 间充质标志蛋白α-SMA、Bax和Bcl-2蛋白表达量，通过CCK-8法检测出10ng/mol的TGF-β2可以成功构建PCO体外细胞模型。QUE可以抑制TGF-β2诱导的HLE-B3细胞异常增殖，促进其凋亡，且这种作用呈明显的浓度相关性；Western blot检测出TGF-β2诱导的HLE-B3细胞中，可以上调α-SMA及下调E-cadherin蛋白表达量；同时QUE对TGF-β2诱导的HLE-B3细胞，也可上调Bax及下调Bcl-2蛋白表达量，从而我们得出QUE通过上调Bax蛋白表达，同时下调Bcl-2蛋白表达，达到治疗PCO的目的。这将为后续临床推广和中医临床应用提供了重要的参考依据。

参考文献:

[2]解芳,钟洪珊,张林.后发性白内障发生机制研究进展[J].现代生物医学进展,2008,(4):754

[6]文磊,温耀春,顾起宏.天然药物在后发性白内障治疗的研究进展[J].实用防盲技术,2011,6(4):178

[11]刘敏.长链非编码RNA CCAT1参与转化生长因子TGF-β2介导的晶状体上皮细胞间质化的研究[D].长春:吉林大学,2021

[13]郭瑞.TGF-β-2通过PI3K/Akt信号通路诱导人晶状体上皮细胞上皮—间质转化[D].南京:南方医科大学,2013

[14]葛茸茸.TGF-β经mTOR信号通路调控后发性白内障的机制研究[D].上海:第二军医大学,2017

基金资助:武汉市医学科研项目(WX20A15);湖北省自然科学基金(2020CFB673);湖北科技学院五官医学院专项科研项目(2020XZ36);

文章来源:曾诚,余才翰,胡军,等.体外实验验证槲皮素治疗后发性白内障的作用机制[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(03):204-208+213.