沙门菌是重要的人畜共患病原菌之一,可在一年中的任何时候引起人或动物发病,导致感染率增加[1]。随着社会的发展,宠物数量不断增加,犬和猫在宠物种类里占据较大的比重,由于人与犬、猫之间的亲密接触,增加人畜共患病发生的可能性,即使是没有任何症状的健康犬和/或猫,也可能通过粪便、尿液等传播沙门菌,并通过环境感染给其他动物和/或人[2,3]。随着临床上抗菌药物的广泛使用,宠物源沙门菌的耐药性问题凸显出来,高耐药率和多重耐药菌株的出现,导致人类和宠物沙门菌病的治疗面临难题[4]。随着生活水平的提高,人们越来越致力于宠物福利,人类感染治疗的首选抗生素也常用于小动物临床[4]。目前我国并未建立小动物细菌耐药性监测体系,无法指导小动物临床抗生素合理使用和评估宠物源细菌耐药性传递到人类的风险。因此,本研究采集不同饲养环境和不同健康状态下宠物的肛拭子样,从中分离沙门菌,进行药物敏感性试验与耐药基因检测,从而了解该地区不同饲养环境和不同健康状态下宠物源沙门菌的耐药与耐药基因流行现状,加强耐药菌株的监测,减少耐药菌株由宠物向人传递的几率。

1、材料与方法

1.1样品采集

2017年7月对新疆乌鲁木齐的6家宠物医院和1家流浪动物救助站进行样品采集(采集对象为犬和猫),通过肛拭子在直肠采集样品共307份,其中健康动物粪样234份,患病动物粪样73份,患病动物主要为消化系统疾病,其次为呼吸系统疾病和外伤。

1.2质控菌株、培养基与试剂

大肠杆菌标准质控菌株ATCC25922购自天和微生物试剂有限公司(杭州)。麦康凯培养基、氯化镁孔雀绿增菌液(rappaport-vassiliadismedium,MM)、MH(mueller-hinton)培养基和SS琼脂均购自奥博星生物技术有限公司(北京)。

试剂:琼脂糖胶回收试剂盒与EB染色液以及MarkerⅡ、2×TapPCRMasterMix,均购自天根生化科技有限公司(北京);BstF5I酶购自NEB公司;琼脂糖凝胶原产于西班牙。

1.3沙门菌分离鉴定

从样品管中吸取50μL样品至1mL灭菌MM增菌液中,于37℃培养48h后用灭菌接种环在SS琼脂培养基上划线,37℃恒温培养18～24h后,挑取中间黑色周围透明的单菌落至1mLMM增菌液中,增菌12h后在沙门菌显色培养基上划线培养,挑取培养基上紫红色单菌落并保存备用。由生物工程股份有限公司(上海)合成沙门菌管家基因invA引物,序列为:下游引物invA-R:5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′,上游引物invA-F:5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′,扩增目的片段大小为284bp[5],对分离菌株进行验证。将分离鉴定的沙门菌根据动物的健康状态分为健康动物源与患病动物源两类;根据不同饲养环境将分离的沙门菌分为流浪动物源与家养动物源两类。

1.4药敏试验

受试药品:环丙沙星(CIP)、诺氟沙星(NOF)、恩诺沙星(ENR)、阿莫西林/克拉维酸(A/C)、头孢噻呋(CEF)、氨苄西林(AMP)、安普霉素(APR)、阿米卡星(AMK)、硫酸庆大霉素(GEN)、卡那霉素(KANA)、四环素(TE)、氟苯尼考(FLR),上述药品的标准品/对照品均购自中国兽医药品监察所。运用琼脂稀释法[6],对分离鉴定出的沙门菌进行抗菌药物最小抑菌浓度(MICs)测定。

1.5耐药基因检测

依据参考文献[7,8,9,10,11,12]由生物工程股份有限公司(上海)分别合成β-内酰胺酶基因(blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、blaLAP-1、blaKPC、blaOXA和blaCMY-2)、PMQR因子(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、oqxA、oqxB和aac(6′)-Ib)、四环素类基因(tetA和tetB)、氨基糖苷类基因(armA、rmtB、aadA2和ant(3″)-Ia)、酰胺醇类基因(floR)引物,待引物收到后先要对其进行3000r/min离心2min处理,再按引物说明要求进行稀释,完成之后对上述22种耐药基因分别进行PCR检测。用BstF5I酶进行酶切已检出aac(6′)-Ib基因的PCR产物,如果存在-cr突变情况,那么aac(6′)-Ib基因将失去BstF5I酶的限制性位点并出现不能被切割现象。再次通过观察琼脂糖凝胶电泳图谱的条带可以获得aac(6′)-Ib基因中-cr有无突变现象。

1.6统计分析

耐药率差异统计采用SPSS20.0软件,用卡方检验做差异性显著分析,结果以平均值的形式表示,以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2、结果

2.1不同健康状态和不同饲养环境中宠物源沙门菌分离鉴定

图1为SS琼脂培养基上划线,37℃培养18～24h后沙门菌生长情况。图2为部分沙门菌PCR鉴定结果,挑取的疑似沙门菌均含有invA基因,且目的条带单一明亮,无杂带。

从307株样品中共分离出99株沙门菌,整体分离率为32.2%(99/307)。由表1可知,患病动物沙门菌分离率(53.4%,39/73)显著高于健康动物沙门菌分离率(25.6%,60/234)(P<0.05)。此外,流浪动物沙门菌分离率(78.4%,29/37)显著高于家养动物沙门菌分离率(25.9%,70/270)(P<0.05)。

图1分离菌在SS培养基上生长状态

图2部分宠物源沙门菌invA基因检测结果

表1不同健康状态和不同饲养环境的宠物源沙门菌分离结果

2.2宠物源沙门菌的耐药及多药耐药情况

99株宠物源沙门菌对四环素、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林和氟苯尼考这7种抗菌药物的耐药率依次为6.1%(6/99)、3.0%(3/99)、3.0%(3/99)、3.0%(3/99)、2.0%(2/99)、2.0%(2/99)和2.0%(2/99);对头孢噻呋、安普霉素、阿米卡星、硫酸庆大霉素和卡那霉素这5种抗菌药物100%敏感。

多药耐药结果显示,99株宠物源沙门菌多药耐药以0耐为主(91.9%,91/99),1耐次之,占5.1%(5/99)。4耐菌株、5耐菌株和7耐菌株各检出1株,检出率为1.0%。

2.2.1不同健康状态宠物源沙门菌的耐药及多耐情况

由表2可知,健康宠物源沙门菌对四环素、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林和氟苯尼考这7种抗菌药物的耐药率均为1.7%(1/60);患病宠物源沙门菌对四环素耐药率最高为12.8%(5/39),对环丙沙星、诺氟沙星和恩诺沙星的耐药率均为5.2%(2/39),对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林和氟苯尼考这3种抗菌药物的各检出1株耐药菌株,耐药率为2.6%(1/39);不同健康状态宠物源沙门菌对头孢噻呋、安普霉素、阿米卡星、庆大霉素和卡那霉素这5种抗菌药物100%敏感。

多药耐药结果显示:健康动物多药耐药以0耐为主(95%,57/60),检出2株1耐(3.3%,2/60)菌株和1株5耐菌株(1.7%,1/60);患病动物多药耐药以0耐为主(87.1%,34/39),检出3株1耐菌株,占7.7%(3/39),4耐菌株和7耐菌株各检出1株,检出率均为2.6%(1/39)。

表2不同健康状态宠物源沙门菌对12种抗菌药物的耐药情况

2.2.2不同饲养环境宠物源沙门菌的耐药及多耐情况

由表3可知,流浪宠物源沙门菌对被检的12种抗菌药物100%敏感,无耐药菌株检出;家养宠物源沙门菌对四环素、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林和氟苯尼考这7种抗菌药物的耐药率依次为8.6%、4.3%、4.3%、4.3%、2.9%、2.9%和2.9%。

表3不同饲养环境宠物源沙门菌对12种抗菌药物的耐药情况

多药耐药结果显示:流浪动物宠物源沙门菌因无耐药菌株检出,故多药耐药为0耐(100.0%,29/29);家养动物多药耐药以0耐为主(88.6%,62/70),1耐次之,占7.1%(5/70),4耐菌株、5耐菌株和7耐菌株各检出1株,检出率均为1.4%(1/70)。

2.3宠物源沙门菌耐药表型与耐药基因型

宠物源沙门菌耐药基因检测结果如下:对floR的检出率为3.0%(3/99);ant(3″-Ia、tetA、tetB检出率均为2.0%(2/99);blaTEM、oqxA、aac(6′)-Ib检出率均为1.0%(1/99),对aac(6′)-Ib的PCR产物用BstF5I酶进行酶切,存在-cr变异,未检出其他被检耐药基因。

耐药率与耐药基因检出率比较发现,耐药率稍高于耐药基因检出率,如对β-内酰胺类耐药率为4.0%(4/99),但相应基因检出率为1.0%(1/99);对喹诺酮类耐药率为9.1%(9/99),相应耐药基因检出率为2.0%(2/99);对四环素类耐药率为6.0%(6/99),相应耐药基因检出率为4.0%(4/99);对酰胺醇类耐药率为2.0%(2/99),耐药基因检出率为3.0%(3/99);未检出氨基糖苷类耐药菌株,却检出2株氨基糖苷类耐药基因。由此可见,耐药率与耐药基因检出率基本一致。

耐药基因共存统计发现,仅有2株沙门菌同时携带ant(3″)-Ia、tetA和tetB3种耐药基因。检测结果详见表4,PCR产物电泳见图3。

表4沙门菌耐药基因检测结果

图3宠物源沙门菌耐药基因PCR检测

3、讨论

3.1不同健康状态和饲养环境宠物源沙门菌分离情况分析

本试验结果中宠物源沙门菌的分离率为32.2%(99/307),略低于林亚军等[13]报道的犬源沙门菌分离率(48.1%),高于陈传荣[2]报道的宠物犬沙门菌分离率(2.3%)。不同健康状态宠物源沙门菌的分离结果显示,患病动物沙门菌分离率(53.4%)显著高于健康动物沙门菌分离率(25.6%),分离率高于盛贤均等[14](健康动物沙门菌分离率为0,患病动物沙门菌分离率为20.0%～40.0%)和龚大春等[15](患病动物沙门菌分离率为27.8%)的报道。不同健康状态沙门菌分离结果显示,动物患病时会携带更多的沙门菌,可能增大沙门菌在动物间的传播几率。

不同饲养环境宠物源沙门菌分离结果显示,流浪动物沙门菌分离率(78.4%)显著高于家养动物沙门菌分离率(25.9%),与廖志伟等[16]报道结果一致,即流浪动物沙门菌分离率(16.0%)高于家养动物沙门菌分离率(7.4%)。流浪动物会接触其他各种各样动物及其粪便,但又不能及时清洁,因而流浪动物粪便中沙门菌的分离率更高。

3.2不同健康状态和饲养环境宠物源沙门菌耐药结果分析

本试验中宠物源沙门菌整体耐药情况不严重,对被检抗菌药物的耐药率在0～6.1%,对四环素耐药率最高(6.1%),耐药结果低于部分报道,如:陈传荣[2]报道的17株宠物犬源沙门菌耐药率在0～35.29%之间;Songsak等[17]报道的122株宠物源沙门菌耐药率在0.8%～100%;王元兰[18]报道的宠物犬沙门菌耐药率在3.6%～27.6%之间。不同地区宠物源沙门菌对临床常用抗菌药物的耐药率差异较大,可能与动物个体的健康状态和用药频率有关;其次,不同宠物医院使用的抗菌药物及用药疗程不同也可能是造成宠物源沙门菌耐药率差异大的原因之一。

本研究还发现,患病动物源菌株的耐药率高于健康动物源菌株的耐药率,可能是对患病动物进行治疗的过程中,抗菌药物的使用导致患病动物源菌株的耐药率升高。此外,流浪动物沙门菌的耐药率显著低于家养动物沙门菌耐药率,但流浪动物沙门菌分离率却显著高于家养动物,分析原因可能是流浪动物接触抗菌药物的机会少,流浪动物被沙门菌侵袭后,无用药机会,多靠自身抵抗力恢复,所以流浪动物虽然沙门菌携带率较高,但这些沙门菌因为没有用药而对被检抗菌药物敏感;而家养动物接触抗菌药物机会多且用药次数多,细菌在用药压力下可通过改变自身的代谢途径或耐药基因发生突变,导致药物活性被抑制或失活,从而表现出耐药或多药耐药[4]。

多药耐药结果显示,乌鲁木齐市宠物源沙门菌多药耐药主要集中在0耐(91.9%)和1耐(5.1%),结果低于林亚军等[13]报道的宠物源沙门菌8耐及以上耐药菌株占97.4%;多药耐药结果远低于其他动物源沙门菌多药耐药结果,如陈玲等[19]报道的动物源沙门菌多重耐药率高达63.75%,关茹飞等[20]报道的鸡源沙门菌的多药耐药结果11耐占15.0%。宠物源沙门菌多药耐药率低于其他动物源沙门菌多药耐药率,原因可能与宠物的生活环境有关,使其感染沙门菌的几率较小。此外,宠物从发病、用药到护理都能够得到主人的关注,滥用药物的机会少,可能也是宠物源沙门菌多药耐药率较低的原因之一。

3.3宠物源沙门菌耐药基因结果分析

本试验耐药基因检出率非常低,对酰胺醇类耐药基因floR检出率最高,也仅为3.0%(3/99),低于黄凯等[21](动物源floR检出率为13.1%)和任士飞等[22](鸭源floR检出率为30.6%)的报道。对四环素类和氨基糖苷类耐药基因检出率均为2.0%,远低于轩慧勇等[23]宠物源tetB(100.0%)的检测结果,但与侯雪娇等[24]报道的食源性沙门菌tetB(3.5%)检出率大致相同。本试验宠物源沙门菌并没有检出氨基糖苷类药物耐药菌株,却检出氨基糖苷类耐药基因ant(3″)-Ia,相关资料表明,细菌对一种药物的耐药可能是几种耐药基因和耐药机制共同作用的结果[3],分析耐药基因ant(3″)-Ia可能不是介导细菌对氨基糖苷类药物耐药主导基因。

此外,PMQR因子和β-内酰胺酶类耐药基因检出率均为1.0%,低于林居纯等[25]和黄巾凌等[26]报道的PMQR因子检出率(oqxA检出率在7.9%～24.6%,aac(6′)-Ib-cr检测率在15.2%～27.5%)。Robicsek等[27]研究发现,aac(6′)-Ib-cr基因所介导的耐药发生率明显高于qnr基因介导的耐药发生率,而aac(6′)-Ib-cr与其他PMQR因子共存现象更容易被检测出来,从而使细菌获得更高水平的耐药,该研究结论可印证本试验PMQR因子耐药基因检出结果。本研究仅检出1株携带blaTEM基因的沙门菌,该菌株来源于患有犬瘟热的宠物犬,推测在治疗过程中,为防止病毒与细菌的交叉感染,采用β-内酰胺类抗菌药物进行治疗,进而导致β-内酰胺酶类耐药基因的产生。

4、结论

新疆乌鲁木齐市患病宠物源沙门菌的分离率及耐药率高于健康宠物源沙门菌,流浪宠物源沙门菌的耐药率低于家养宠物源沙门菌,所有菌株对被检药物的耐药率均未超过10.0%,耐药基因检出率低,且耐药表型与耐药基因型之间呈正相关。结果提示,该地区宠物源沙门菌对被检抗菌药物具有较好的敏感性,故临床上仍可使用头孢菌素类和氨基糖苷类抗菌药物用于犬、猫沙门菌病的治疗。

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基金:国家自然科学基金(31860714)