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马泰勒虫的检测及基因型分析
摘要：探究乌鲁木齐市某景点一例马泰勒虫病的诊断及基因型分析，联合临床诊断、血涂片和PCR方法对疑似马泰勒虫病例进行诊断。确诊后，与GenBank公布的马泰勒虫18S rRNA参考序列对比分析同源性。在MEGA X软件中绘制ML系统进化树探究其基因型分布情况。结果显示该病例具有典型的马泰勒虫病临床症状；血涂片检测发现患马血样中少量梨形虫体；PCR扩增出片段大小为512 bp目的基因片段；基因型分析发现，病例检测出的马泰勒虫属A型，与其同源性较高的，隶属新疆伊犁昭苏、尼勒克等地的代表性马泰勒虫属E型，未见其他属基因型的序列。目前，新疆伊犁地区马泰勒虫基因型为A型和E型，E型居多。研究结果可为马泰勒虫遗传进化分析及基因型与致病性间关系研究提供理论依据。
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马泰勒虫(Theileia equi)隶属于泰勒科(Theileriidae)泰勒属(Theileia),与马驽巴贝斯虫共属马梨形虫，是寄生在马属动物的网状内皮系统和红细胞内的一种蜱传血液原虫[1],也是导致马梨形虫病的主要病原[2],但马泰勒虫的危害远高于马驽巴贝斯虫[3]。感染马泰勒虫的马匹会表现出食欲下降，体温升高，黏膜充血，精神不振的临床症状，若不及时治疗，则会出现腹泻，肠绞痛，严重时，会发生心律失常，共济失调、癫痫等病症。马泰勒虫病多呈急性经过，发病率和病死率较高[4],尤其对外来引进的马属动物危害更大，是制约发展中国家马属动物养殖业发展的原虫病之一[5]。
马泰勒虫病在不同的国家流行程度不同。例如，SANT C[6]等人通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)方法对特立尼达的111匹马进行马泰勒虫检测，发现有24.3%的马被感染；Torres R[7]等人利用套式PCR方法对智利赛马场的457个样本进行马泰勒虫检测，其感染率高达53.6%;Salas D R[8]等人通过PCR方法对墨西哥韦拉克鲁斯州马的100份样本进行检测，结果显示有18.0%的马中存在T.equi。马匹感染马泰勒虫后成为无症状病原携带者，制约它们的跨境活动。我国马匹数量位居世界第二，近年来，关于马泰勒虫流行病学的报道增多。在国内，孙秀涛[9]对广西省部分马匹进行了T.equi的相关报道。新疆地区马术运动蓬勃发展，为促进国内马匹种类繁育发展搭建了平台，但马泰勒虫病一直是阻碍当地马产业健康发展的一种不可忽视的地方病[10]。新疆伊犁是全国重要的运动马及传统马的输出基地之一[11],也是伊犁马主产区[12]。马泰勒虫病在伊犁地区也是常见的家畜原虫病。据文献记载，2017年杨红霞[13]等人的报道了马泰勒虫病导致伊犁一孕马死亡。2022年史倩云[14]等人在昭苏采样过程中也发现了一例马泰勒虫病例。
由上述报道可知，马泰勒虫病在世界范围内各地区流行，在新疆的部分地区也时有发生，但是关于马泰勒虫病在旅游景点的报道及马泰勒虫基因型的研究较少，因此，本研究对在乌鲁木齐周边某旅游景点发现的一例疑似马泰勒虫病的病例进行血涂片检查和PCR检测，并从基因层面探讨了我国的马泰勒虫病基因型类型，旨在为马泰勒虫基因型致病性的防控提供理论参考。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验用动物
2022年5月，乌鲁木齐周边某旅游景点出现一匹在2021年9月份左右，从伊犁昭苏某团场购入的6岁母马发病。采集疑似患马的耳缘静脉血和全血。主诉：此马于3个月前出现发烧，鼻流黄白色鼻涕并伴有出血，排尿呈红黄色，食欲减退，精神萎靡，血液稀薄，黏性下降。
1.1.2 主要试剂
血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购自上海赛百盛基因技术有限公司；PCR试剂，购自北京鼎国昌盛生物公司；快速吉姆萨染色试剂盒，购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.1.3 主要仪器
体式显微镜(M205A型),德国Leica公司产品；生物显微镜(ECLIPSE E200型),日本Nikon公司产品；电泳仪(DYY-6C),北京六一生物科技有限公司；凝胶成像仪(GelDocXR型),美国Bio-Rad公司产品；电子天平(PL303型),梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
1.2 方法
1.2.1 临床症状诊断
视诊观察患病马匹的精神状态，饮食，排粪、排尿情况，触诊结膜有无充血或黄染，躯体是否出现水肿，并给患马测量体温。
1.2.2 血涂片检查
从耳缘静脉采集血液，滴在干净载玻片上，用另一玻片推展成薄膜。按照瑞士染液说明书方法进行染色。染色后将血涂片自然晾干，滴香柏油在油镜下观察。
1.2.3 马泰勒虫18S rRNA基因检测
参照血液/细胞/组织基因组提取试剂盒操作说明书提取患马核酸，置-20℃冰箱备用保存。引物参照罗金等[15]扩增马泰勒虫18S rRNA基因目的片段使用的引物，进行本病例马泰勒虫病的PCR检测。具体的引物信息为F:5′-TTTGGGCTGTTTACAGTTGC-3′;R:5′-CCTCAAAGTAAACGTCG- TCATG-3′,引物合成委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行。采用13μL反应体系，以获得的DNA为模板，进行PCR扩增。反应条件为：95℃预变性5 min; 94℃变性30 s, 55℃/53℃退火30 s, 72℃延伸45 s,循环次数30;72℃再延伸，10 min, PCR体系设立如表1。
表1 PCR反应体系
1.2.4 马泰勒虫基因型分析
参考Ratzon D K[16]等人基于18S rRNA进行马泰勒虫基因型分析的序列信息，以牛环形泰勒18S rRNA基因(登录号：JQ743636)为外群，使用MAFFT V7.487进行序列比对，以Trimal V 1.2rev59中的参数-Automated1进行序列裁剪，使用MEGA X筛选最佳模型为K2+G,以最大似然法(Maximum Likelihood, ML),Bootstrap=1000进行基于马泰勒虫18S rRNA基因构建的系统进化树。
2、结果
2.1 患马临床检查
经诊断发现，患病马匹体温升高(41.2℃)、不食、精神沉郁、呼吸急促、流鼻涕、伴有贫血、比较消瘦、被毛杂乱无光，在其鬃毛处发现疑似蜱虫叮咬的痕迹。
2.2 血涂片
通过瑞士染色发现紫色的圆形类虫体(圆环形、椭圆形),顶端呈现点状的紫色，中间呈现空心圆状，为马泰勒虫，结果见图1。
图1马泰勒虫血涂片(×1 000)
2.3 马泰勒虫18S rRNA检测
经PCR扩增后，将提取的患马核酸一组3个重复，1个阴性对照。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果，在琼脂糖凝胶电泳上出现512 bp大小的目的片段，结果见图2。
图2马泰勒虫18S RNA序列扩增结果
2.4 马泰勒虫基因型结果分析
以先前进行马泰勒虫A、B、C、D、E基因型分型的序列为参考，马泰勒虫基因型分析发现，新疆伊犁马主产区马泰勒虫的基因型以A型和E型为主。C和D基因组同聚一大支，亲缘关系较近，B和E基因型聚为一支亲缘关系较近，而A基因型相对独立。进一步研究发现我国周边国家马泰勒虫基因型属于E型，其中哈萨克斯坦株(MN857677),沙特阿拉伯株(LC431546),俄罗斯株(MG551915),西班牙株(AY534882)和甘肃株(MH651217)5个地区都聚集在E基因型，新疆尼勒克株(ON384628)与俄罗斯株(MG551915)聚为一支，亲缘关系较近，昭苏株(OL589499)等疆内马泰勒虫也汇聚在E型，本研究检测出该患马的马泰勒虫属A型，与其同源性较高的，隶属新疆伊犁地区的昭苏、尼勒克等地的代表性马泰勒虫属E型，未见有属B、C、D基因型的序列。具体见图3。
图3马泰勒虫18S rRNA序列ML系统进化树
3、讨论
马泰勒虫是由中间宿主蜱传播，寄生于马属动物红细胞内的血液原虫，分布广泛[17]。在养殖牧马和赛马的地区，马泰勒虫病普遍流行，严重影响畜牧业发展及畜产品生产。本文探究了伊犁马主产区马泰勒虫基因型类型及分布情况，对乌市周边某旅游景点一例疑似感染马泰勒虫病的马匹进行诊断及基因型析，综合确诊该马患有马泰勒虫病，新疆伊犁马主产区马泰勒虫基因型为A型和E型，E型居多，隶属新疆伊犁地区的昭苏、尼勒克等地的代表性马泰勒虫属E型，未见有属B、C、D基因型的序列。此外，我国周边国家哈萨克斯坦株，沙特阿拉伯株，俄罗斯株，西班牙株和甘肃株5个地区都聚集在E基因型。基于这些主要流行基因型的研究，对于开发马泰勒虫病新的诊断工具和疫苗起关键作用。乌市某旅游景点产生马泰勒虫病是由于基层人员对该病的防控意识不足，对该病的治疗也没有较好的治疗办法，一旦有新出生马匹或外来马匹引入该地区时，则极易发生急性感染，严重时患畜可能直接死亡，从而对该景区造成极大的经济损失。
马泰勒虫病尚无特效疫苗可用，主要以预防为主。防治本病的关键在于消灭马体表和周围环境中的硬蜱，切断传播途径[18]。在蜱的活跃季节，采用人工灭蜱和药物灭蜱相结合的方法，经常检查畜体体表，定期对畜体体表和圈舍彻底喷洒消毒。对外来马匹要严格进行检疫，防止带虫马进入。上述建议可以为旅游景点马泰勒虫的防治提供参考，必要时结合药物治疗。常用防治梨形虫病的药物主要以西药为主，此外，中药因安全环保、低耐药性的特点也被广泛应用于梨形虫病的防治。然而，患病马匹即使后期治疗也可能成为新宿主，作为传染源传播给其他马属动物。因此，在治疗过程，除了对症治疗外，应更加重视临床治愈后的护理，同时增强马匹自身的抵抗力。本研究可为新疆伊犁马主产区马泰勒虫遗传进化分析及基因型与治病特性间关系研究提供理论依据，在今后马匹饲养管理中，可根据本文提供方法进行马泰勒虫病的预防，为大城市旅游健康发展提供指导意义。
参考文献:
[1]刘铮,张义伟,李茜茜,等.马梨形虫病及其诊断方法概述[J].中国动物检疫,2019,36(10):66-70.
[2]刘世芳,郭庆勇,闻秀秀,等.中国新疆部分地区马泰勒虫感染的差异性及系统发育分析[J].新疆农业科学,2017,54(11):2130-2137.
[4]瞿业宏,岳城.新疆阿勒泰地区马梨形虫病流行病学调查[J].中国兽医杂志.2021,57(03):43-46.
[9]孙秀涛,吴杰,李朝,等.云南省红河州马梨形虫病血清学检测[J].中国动物检疫,2018,35(08):10-12.
[11]罗鹏辉.新疆马产业发展现状分析[J].新疆畜牧业,2022(03):037.
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[13]杨红霞,张杨,刘世芳,等.马泰勒虫病致死孕马报道[J].中国兽医杂志,2017,53(11):50-51.
[14]史倩云,徐文慧,奴尔兰·阿克亚孜,等.1例伊犁昭苏县马泰勒虫病典型病例的治疗体会[J].现代畜牧兽医,2022(06);44-47.
[15]罗金,刘光远,谢俊仁,等.马泰勒虫病PCR检测方法的建立和应用[J].中国畜牧兽医,2012,39(02):28-31.
[17]刘世芳,阿拉西·阿滨,宋瑞其,等.新疆昭苏县马泰勒虫病的诊疗及其效果观察[J.动物医学进展,2017,38(08):122-125.
基金资助:国际合作项目(2021E01001);新疆维吾尔自治区区域协同创新专项-上海合作组织科技伙伴计划及国际科技合作计划项目(2021E01001);
文章来源:温丽翠,李才善,葛晓敏等.马泰勒虫的检测及基因型分析[J].动物医学进展,2023,44(10):136-139.
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2023-10-22
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