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玉米秸秆辅料发酵猪尸体生态系统微生物多样性的变化研究

2023-12-13 80 上传者：管理员

摘要：该研究为揭示玉米秸秆发酵辅料对猪尸体生物发酵池中微生物多样性的变化。实验建立生物发酵池，并从中采样5次，每次采样4个位置共20组。采用16S rDNA测序技术对稳定运行的发酵池内微生物多样性和结构组成进行研究，建立进化树和多样性分析讨论。不同的优势菌群影响着发酵的进程，厚壁菌门（芽孢八叠球菌属、微小杆菌属）、变形菌门（拟产碱菌属）细菌为3种发酵优势菌群。

关键词：
16S rDNA测序
微生物多样性
玉米秸秆
生物发酵
生猪尸体
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据统计，62%的人类传染病都是经由动物向人类传播的[1]，通过流行病学调查，发现感染禽流感的患者往往与病禽有接触史，所以无害化处理病害动物是阻断人兽共患病传播的有效措施[2]。如果是重大动物疫病或人畜共患病病原传播，就有可能引发重大动物疫情或人畜共患病疫情，威胁生态环境安全，危害公共卫生安全，影响畜牧养殖业的健康发展。随着养殖规模的不断扩大，病死动物科学无害化处理的重要性愈加明显。利用微生物发酵技术无害化处理动物尸体是当今社会越来越关注的话题。张德等[3]应用复合菌制剂，以猪粪、米糠、泥炭土做辅料，对猪尸体进行发酵处理；隋士元等[4]利用发酵辅料、降解菌进行高温生物降解动物尸体；邱进杰等[5]选用粪渣做发酵辅料对猪尸体进行生物降解。Adani F等[6]开展研究微生物堆肥过程中有机物的变化情况。最早出现官方报道生物发酵法是2004年加拿大哥伦比亚地区暴发禽流感后，有关部门成功用此方法处理了约170万家禽尸体[7]。陈腾飞等[8]对生物发酵分解工艺处理的病死猪尸体进行病原检测和处理前后病原微生物的检出率对比，得出生物发酵分解工艺可以基本做到无害化处理病死猪尸体的结论。宋晓军[9]证明，在静态无害化堆肥发酵实验结束时，已经检测不到猪场常见的病毒RNA，而且死亡生猪尸体也完全得到降解。在发酵体系中，动物尸体和发酵辅料一起为微生物生长提供有机质及碳源和氮源等能量，动物尸体在微生物生长繁殖过程中被利用和降解，同时发酵过程中由于微生物的活动产生高温（生物热），将尸体中携带的病原微生物杀灭。生物发酵法[10]初期投入低，原料来源广泛，环境污染程度小，最终产物可利用，但目前关于辅料发酵无害化处理尸体的相关研究还不是很多。本实验以玉米秸秆辅料进行生物发酵后，采用16S rDNA测序技术对稳定运行的发酵池内微生物多样性和结构组成进行研究，揭示不同时间下发酵池生态系统的多样性变化特征，分析优势菌群，为后期玉米秸秆辅料发酵处理动物尸体的发酵情况提供科学依据。

1、材料与方法

1.1 建造病害动物生物发酵池

2020年12月开始进行发酵实验场地准备，外界温度平均14℃，用水泥砌成1个长2.5 m、宽1.5 m、高2 m的长方体发酵池，底部留有一定空隙以便保证底部可以有氧气供应，在尸体上下都放有45 cm左右的发酵辅料，用塑料薄膜覆盖。

1.2 样品采集

发酵使用的猪尸体来源于实验室自养猪，发酵辅料使用玉米秸秆，分5个温度点使用无菌尖头采样铲，采集堆肥样品的发酵样品，每份采集4个位置，立即带回实验室中，共20份，置于4℃保存，进行细菌种类的分析，见表1。

表1 采样时的温度和pH值

1.3 样品的纯化及Illumina高通量测序

对基因组DNA抽提，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后合格的，进行后续操作。选择V4区域作为16S rDNA的扩增区域，用带有Barcode的特异引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）进行扩增。每个样本重复3次，PCR结束后将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收PCR产物，用Qubit 2.0(ThermoFisher公司）进行检测定量，使用Illumina PE250进行上机测序

1.4 数据分析

采用FLASH对测序得到的PE reads拼接，去除低质量碱基及接头污染的序列，得到高变区的长Reads。利用UPARSE算法进行标准聚类（97%相似度），使用Uchime对嵌合体进行过滤，得到OTU代表序列。用Silva等数据库划分物种分类信息，去除注释为叶绿体、线粒体以及非细菌或古菌界的OTU。之后用PyNAST算法比对并过滤代表性序列，使用FastTree重构进化树。通过进化树进行物种间的进化关系和生态学方面的计算。基于此，在群落组成水平和系统发育水平上用QIIME做出相应的稀释曲线且用R、Mothur等软件对样本进行多样性分析和群落结构的差异性分析等。

2、结果

2.1 OTU水平分析

如图1A和图1B所示，本研究获得的序列长度在275～330，聚类共产生3 640个OTU(Operational Taxonomic Unit），说明本研究共产生了3 640个物种。分析各样本属水平的韦恩图（图1B）可知，5组相同的有OTU数量有617个，A、B、C、D、E组独有的OTU数量分别为450、293、92、364、271个，说明各个组在属水平上的微生物存在一定的差异，其中A组的OTU数量最多，C组OTU数量最少。还可以看出，各组之间的OTU数量排序为A>D>B>E>C，说明在第18天（C组）杀灭的微生物最多，第3天（A组）刚开始进行发酵且温度也不够高，所以对微生物的杀灭能力不强。在序列相似性为97%以上的OTU稀释曲线和Shannon曲线趋向平坦，说明该组数据具有足够的测序深度，且测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数微生物信息，见图1C。丰度等级曲线较为平滑，表明3 640个OTU聚类的物种分布较为均匀，见图1D。

图1 玉米秸秆辅料发酵过程中细菌OTU聚类分析

2.2 细菌群落组成分析

玉米秸秆发酵过程中细菌的群落组成和丰度，在各分类阶元上具有明确的分类信息，见图2。在纲水平的群落组成占多数的是芽孢杆菌纲、β-变形菌纲、梭菌纲、γ-变形菌纲。在属水平的群落组成中，A组（42.5℃，第3天）的优势菌属是芽孢八叠球菌属、泰氏菌属，B组（61.6℃，第8天）的优势菌属是芽孢八叠球菌属、葡萄球菌属、拟产碱菌属，C组（59.1℃，第18天）的优势菌属是芽孢八叠球菌属、微小杆菌属，D组（42.6℃，第28天）的优势菌属是微小杆菌属、芽孢八叠球菌属、拟产碱菌属，E组（23.3℃，第40天）的优势菌属是芽孢杆菌属、产碱杆菌属。在整个发酵过程中，芽孢八叠球菌属在每组中都有占一定比例，到42.6℃（第28天）之后含量变少，说明其在发酵过程中起着重要作用，待发酵结束，含量也随之减少；泰氏菌属仅在42.5℃（第3天）含量非常多，说明其不是发酵优势菌，随着发酵的逐步开始，含量越来越少，甚至消失；葡萄球菌属刚开始42.5℃（第3天）含量很少，在61.6℃（第8天）含量最多，然后又减少，说明其参与刚开始的发酵过程，在之后发酵过程中，其不适合发酵环境而随时间减少；拟产碱菌属在61.6℃（第8天）和42.6℃（第28天）中含量较多，说明其是参与高温发酵的优势菌群；微小杆菌属在59.1℃（第18天）和42.6℃（第28天）居多，说明刚开始和发酵结束时不适合其生长；产碱杆菌属和芽孢杆菌属在23.3℃（第40天）中含量最多，说明该2种菌群不是参与发酵分解的主力军，发酵结束的环境适合其生存。

图2 玉米秸秆辅料发酵过程中菌群群落组成

2.3 进化树分析

使用进化树可分析物种间的进化关系，也可为Alpha多样性和Beta多样性等分子生态学方面进行计算。使用最大似然法进行建树，选用丰度最高的50个OTU进行展示，见图3。粪产碱菌与拟产碱菌属下的菌种进化关系近，其都属于变形菌门的β-变形菌纲。库特杆菌属、微小杆菌、葡萄球菌、芽孢杆菌、芽孢八叠球菌的进化关系近，都属于厚壁菌门的芽孢杆菌纲。

图3 丰度最高的50个OTU的进化树展示

2.4 Alpha多样性分析

Alpha多样性分析表示，D组和E组Observed species指数差异显著（P<0.05），其他各组之间差异不显著，说明玉米秸秆辅料在第28天（D组）时丰度最大；Chao1指数、Shannon指数、PD指数在各组之间差异不显著，说明各组内之间的物种丰度差异不显著，见图4。Sha n n o n指数大于1，说明该群落具有较高的生物多样性。

图4 物种丰富图

2.5 Beta多样性分析

Beta多样性描述物种组成在时间与空间上多样性的差异程度。PCo1值为20%，则x轴的差异可以解释总差异的20%。样本NMDS的stress值为0.12<0.2，说明结果有一定的可靠性。B、C、D组之间距离较近，说明微生物群落在第8、18、28天变化不大；A组与E距离较远，说明第3天与第40天的微生物群落组成差异较大。样品Beta多样性分析各指数见图5、图6。

图5 主成分分析和主坐标分析

图6 基于非加权unifrac距离的非度量多维尺度分析

3、讨论

微生物菌群结构的改变是造成菌群发酵性能变化的重要原因[11,12]。随着发酵时间的变化，5个温度段的优势菌群在芽孢八叠球菌属、泰氏菌属、葡萄球菌属、拟产碱菌属、微小杆菌属和芽孢杆菌属之间变化。芽孢八叠球菌为中度嗜碱菌，有非常高的脲酶活性，能极高地降解尿素，并基于尿素降解碳酸钙生物矿化活性，还可以治理环境中的重金属污染[13]。泰氏菌属存在于厌氧污泥和人体胃肠道中[14]，通常会产生醋酸盐、氨和CO2[15]。葡萄球菌属适宜弱碱环境下生长，在空气、土壤、食品等地方都能存活。微小杆菌属于嗜碱菌，能发酵葡萄糖、蔗糖等糖类产酸，产生乳酸、乙酸和甲酸等，且他的生长温度非常广泛[16]。芽孢杆菌是土壤蛋白酶的主要来源[17]，能抑制真菌、葡萄球菌生长，降低环境pH值，产生CO2[18]。产碱杆菌具有硝化能力和亚砷酸盐氧化能力[19]，会抑制葡萄球菌、变形杆菌的生长[20]。王海鹏[21]研究表明，厌氧发酵纤维类物质，pH值保持在7～9时，可以有效提高沼气的产量。谢彩华等[22]研究发现，耐高温降解菌种的选择对生物发酵分解工艺的无害化处理影响较大。

评价多样性的各项指标参数，发现各实验样品所含物种的丰富度和均匀度之间有较小的差异，表示发酵池内微生物多样性变化较小，维持在一个较为稳定的状态。微生物群落组成的变化可能进一步影响发酵池内温度变化。张彤[13]和Liu S等[23]研究发现，中高温利于微生物发酵，碱性条件可以促进高温消化过程中有机物的还原，这与本发酵实验结果相符合。本实验样本数量过少，微生物多样性变化预测可信度偏低，需要进一步开展大样本的实验进行验证。

发酵40 d结束后，发酵池中的有机物大部分被分解，仅剩下难以分解的纤维素等稳定物质，营养物质基本被消耗完毕，微生物活动减缓或停止，发酵体系温度降低。发酵结束后的产物，可以用来当作有机肥供种植业使用，使资源再利用[24]。另外，发酵产物中的菌种可以考虑后续再利用，如芽孢杆菌中的枯草芽孢杆菌在食品制造业中可以做食品防腐剂[25]，在养殖业可以促进鸡的生长发育[26]。

本实验建立生物发酵池，并采用16S rDNA测序技术对稳定运行的发酵池内微生物多样性和结构组成进行研究。在发酵池生态系统运行过程中，各组微生物多样性的差异不明显，但结构组成随着温度的变化而变化；pH值基本维持在弱碱性，提供了良好的发酵条件。经过40 d发酵，池内主要存在芽孢八叠球菌属、芽孢杆菌属、产碱杆菌属细菌，大部分有机物已被分解完毕。研究结果为后续玉米秸秆辅料的生物发酵提供基础数据。

参考文献:

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基金资助:生物发酵处理动物尸体示范性研究(KX141335);云南省重大科技专项计划项目:抗畜禽腹泻兽药创制(202302AA310020);云南省重大科技专项计划项目:云南高原猪鸡饲料高效生产与利用关键技术研发与应用(202202AE090024);云南省石林县奶山羊产业科技特派团(202104BI090017);云南农业大学兽医公共卫生省创新团队(202105AE160014);

文章来源:平宇明,项勋,杨志远等.玉米秸秆辅料发酵猪尸体生态系统微生物多样性的变化研究[J].现代畜牧科技,2023(12):38-43.