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1例KCNH2基因突变致长QT综合征病例分析

2023-12-05 85 上传者：管理员

摘要：目的:探讨长QT综合征的致病基因及其基因突变与临床表型的相关性。方法:回顾分析1例可疑长QT综合征患儿的临床资料,并利用全外显子测序(WES)筛查可能导致长QT综合征的突变。利用致病性评分、遗传模式及Sanger测序验证突变。结果:基因检测结果提示患儿存在KCNH2基因c. 3100＿3109delGACACGGAGC杂合突变,各类预测软件提示该突变是有害突变。Alphafold分析提示该突变会导致蛋白质截短。结论:KCNH2基因c. 3100＿3109delGACACGGAGC杂合突变是本例患儿的致病突变,并且该突变可能影响了KCNH2蛋白的稳定性。

关键词：
KCNH2突变
全外显子测序
心源性猝死
生物信息学
长QT综合征
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心源性猝死是无心脏结构性病变的儿童和青少年死亡的主要原因之一,约占总人数的40%[1,2]。长QT综合征(LQTS)是一种常染色体显性遗传性心血管疾病,发病率约为1/2500,其临床特点为QT间期延长、T波改变、反复发作的晕厥及癫痫[3]。到目前为止,已有7个基因突变被证实与长QT综合征有明确联系,最常见的3个基因为KCNQ1、KCNH2及SCNA5,分别为1型LQTS(LQT1,30%～35%)、2型LQTS(LQT2,25%～40%)以及3型LQTS(LQT3,5%～10%)[4,5]。这些基因都在离子通道的功能失调与维持心肌细胞动作电位及延迟去极化中起着关键作用[3]。

LQT2占LQTS的25%～40%,由KCNH2突变导致[3]。KCNH2基因(又称为人类快速延迟性整流性钾通道基因,h ERG)位于7号染色体,由20个外显子组成[6]。KCNH2主要编码电压依赖性快速延迟整流钾通道(IKr)的α亚通道Kv11.1,4个Kv11.1亚单位组成1个四聚体离子通道,主要负责心脏复极时的延迟整流钾电流[6]。心肌细胞内的快速延迟整流钾电流受KCNH2基因产物Kv11.1α及Kv11.1b亚单位及辅助亚基MiRP1(KCNE2)调控[7]。KCNH2的失功能突变(LOF)已被证实是导致LQTS发生的主要原因[8]。KCNH2的LOF突变会减弱复极化时IKr的活动,继而延长动作电位间期,最终导致QT间期延长[9]。目前已有超过500个KCNH2突变被证实与LQTS有关。KCNH2突变导致的LQTS根据分子机制不同可以分为4种类型:第一类是KCNH2编码的通道合成异常,第二类是突变干扰Kv11.1通道蛋白运输,第三类是Ikr门控特性受损,第四类是Ikr通道离子通透性异常[7,9]。目前已知疾病的严重程度与突变类型、突变的位置及离子通道功能紊乱的程度有关[3,10]。在临床上,LQTS患者的一线用药是β-肾上腺素受体拮抗剂[11]。然而,一旦患者没有及时接受治疗,其预后极差。近年来,随着对于由基因突变导致的心律失常的理解加深,基因层面的个体化治疗已被广泛应用[12]。但对于KCNH2突变的筛查还不全面。

本研究利用全外显子测序(WES)检测出1例患有LQTS的女童具有KCNH2基因杂合突变(NM＿000238.3:c.3100＿3109delGACACGGAGC)。同时,其母亲也携带有KCNH2杂合突变,并伴有QT间期延长。本研究结果表明,LQTS的发生与KCNH2突变有关,并且应在未来的临床实践中对KCNH2突变进行筛选。

1、资料和方法

1.1 病例资料

本研究对象为一安徽籍家庭,包括父母及女儿共3人。先证者是1例10岁女性患儿,因“间断发作性晕厥1年余,发作两次”入院,初步诊断为LQTS。心电图检查示QT间期延长,QTc=474mms。平素健康状况良好,无疾病史。患儿接受了相关药物治疗。

1.2 全外显子测序及突变的识别

采集所有受检者的外周血并使用全血基因组DNA抽提试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取受检者的基因组DNA,1μgDNA用于建库。使用Nimblegen SeqCapEZExomev3(罗氏)进行对患儿样本基因进行扩增,并且使用Hiseq2500平台测序,每个样本产生2×100bp的末端测序数据,将测序结果与人类基因组hg19进行比对。测序完成后,使用自主研发的软件对数据进行过滤,使用BWA-0.710软件将数据与人类基因组数据库(GRCH37/hg19)进行比对。随后识别并过滤单核苷酸及插入缺失突变,利用千人基因组、ExAC、gnom AD、Clinvar(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)、人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、人类基因突变数据库(HGMD)以及我院的全外显子测序数据库进行注释。筛选出的突变根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)突变解读指南被分类为致病、可能致病、无义突变。随后使用Provean、MutationTaster及CADD等软件预测候选基因的致病性。

1.3 Sanger测序及数据分析

使用Sanger测序验证KCNH2突变。首先设计用于扩增跨越KCNH2基因突变片段的引物。用于扩增的引物序列如下,F:5′-TGGGAGTTCTTGGTCGGCTTGA-3′;R:5′-CAGCGTCATCTGCCTCTGTAGC-3′。PCR产物使用QIAquickkit试剂盒(Qiagen,Germantown,MDUSA)进行溶解及纯化。PCR产物送苏州鸿迅生物科技有限公司进一步测序。

1.4 实时定量PCR(RT-qPCR)

RT-qPCR用于分析患儿及其父母的m RNA水平变化。250μL外周血用于提取总RNA,使用PrimeScriptTMRT MasterMix(Takara,日本)对1μgRNA进行逆转录反应得到模版DNA(cDNA)。设计用于检测KCNH2突变对表达影响的引物。引物序列,F:5′-ACAAGGACGGAGCAGCCA-3′;R:5′-GCTCTTCTCGCAGTCCTCCATC-3′。RT-qPCR的条件如下:95℃10s,60℃30s,扩增40个循环,最后95℃10s,65℃60s,97℃1s做熔解曲线。

2、结果

2.1 先证者临床表型

先证者(图1中箭头所指)在9岁时,与同学玩闹戳伤眼睛后出现头晕、心悸、气促,持续2～3分钟后晕厥,表现为两眼上翻,牙关紧闭,呼之不应,持续5分钟后好转,意识清醒,醒后呕吐一次,为胃内容物。3个月后,患儿上体育课后自觉全身发麻,四肢乏力,持续2～3分钟后晕厥,症状同前。当地医院24小时动态心电图检查提示:(1)QT间期延长,平均QTc为470～490mms;(2)间歇性V1导联呈不完全性右束支阻滞图形;(3)偶发室性早搏(单发,插入性)。心脏超声未见异常。10个月后患儿跑步后出现头晕、心悸,于我院就诊,心电图提示:(1)QT间期延长,QTc为474mms;(2)T波改变(各导联T波钝),见图2。患儿脑电图提示为异常脑电图,见图3。颈动脉超声及运动耐力试验均无异常。患儿母亲的心电图也提示QT间期延长,QTc456mms,见图4。根据患儿家族病史及心电图检查,患儿被诊断为LQTS,给予心律平150mg/d及普萘洛尔60mg/d治疗。经治疗后,患儿症状得到明显改善未再次出现晕厥。

2.2 突变位点检测

先证者中共筛选出18546个常见突变。剔除非编码及无义突变和预测为非致病性突变后,最终共筛选出53个基因中的67个突变。根据数据库及患儿临床表型分析,确定了单一基因中的单一突变,即KCNH2(c.3100＿3109delGACACGGAGC,图5)。该突变导致KCNH2蛋白1034位脯氨酸开始出现移码突变[KCNH2,p.(Pro1034Thrfs∗20)]。MutationTaster软件预测该突变为致病性且可能性为1。Provean软件预测评分为-72.967分,提示突变为“有害”。CADD软件预测Phread分数为33.0,也提示突变为“有害”。

图1 患儿家系图谱

图2 患儿心电图

图3 患儿脑电图

图4 患儿母亲心电图

图5 筛选可能的致病突变流程

2.3 Sanger测序验证

根据筛选结果提示,患儿的移码突变位于KCNH2的第13号外显子。Sanger测序证实患儿KCNH2的突变(图6)。家系遗传筛查显示患儿的母亲也携带有KCNH2基因杂合突变(图6)。进一步通过RT-qPCR验证KCNH2m RNA水平在该家系中的表达,结果表明KCNH2在患儿及其母亲体内的m RNA表达水平约是其父亲m RNA表达水平的1/2(图7)。移码突变[p.(Pro1034Thrfs∗20)]位于KCNH2蛋白C端的跨膜结构域外(图8)。前期研究也报道了LQT2型患者携带有KCNH2移码突变(c.3101＿3108delGACACGGAGC)[13],该位点与本研究筛选出的KCNH2(c.3100＿3109delGACACGGAGC)突变极为接近。基于以上结果,KCNH2突变可能会影响其蛋白功能。

2.4 突变对蛋白质的影响分析

为了进一步分析KCNH2突变后的影响,本研究进行了HNN二级结构预测从而分析KCNH2蛋白二级的改变。将突变后KCNH2蛋白结构与其野生型蛋白结构进行对比后发现KCNH2突变导致KCNH2蛋白氨基酸序列发生截断。Alphafold软件建模结果表明,KCNH2移码突变位于卷曲螺旋结构域,从而导致了蛋白质合成的提前终止,最终产生了截短体蛋白(图9)。这些结果表明,KCNH2突变可能通过改变KCNH2蛋白结构导致LQTS的发生。

3、讨论

本研究通过对1个汉族LQTS家庭进行全面的致病基因筛查及临床表型分析,寻找到新的可能的致病突变。最终结果显示该例患儿的KCNH2(c.3100＿3109delGACACGGAGC)突变为新发突变;蛋白质建模结果表明KCNH2杂合突变会影响其蛋白合成。因此,KCNH2(c.3100＿3109delGACACGGAGC)突变会影响其蛋白功能,在遗传性LQTS的起病中起到关键作用。

图6 患儿家系Sanger图谱

图7 患儿及其父母的KCNH2 m RNA相对表达水平

图8 KCNH2亚单位

图9 突变对蛋白质功能影响的预测

慢性LQTS是一种遗传性离子通道病,青少年多发。临床特点表现为QTc延长、晕厥及猝死。目前已知,LQT2患者除了表现为QTc延长外[QTc(470±30)mms)],还具有T波形态改变,包括不对称,低电压,双相及缺口T波[14]。本例患儿心电图结果提示,QTc延长,QTc为476mms,同时伴有有T波低电压。此外,其母亲心电图检查也同样表现出QTc延长。更为重要的是,本例患儿脑电图结果提示可能具有癫痫的表现。在基于外显子组分析对61例猝死的癫痫患者的研究中发现,KCNH2是前30个突变的基因之一[15]。另有研究证明,LQT2患者出现继发于心律失常的脑低灌注性癫痫的阈值更低,女性更易发生癫痫[16,17]。目前已在海马新型胶质细胞、小脑浦肯野细胞及前庭核神经元发现有KCNH2转录本的表达[18]。KCNH2基因编码钾离子通道,而IKr的复极对于神经高度活跃时星型胶质细胞介导的细胞外钾离子转导是至关重要的[19]。此外,合并有癫痫的LQTS患者心脏症状也会更为严重,包括QTc的进一步延长,致命性的室性心律失常的发生概率更高以及猝死风险增加[20,21]。虽然在本例患儿中,除KCNH2突变外,还检测出了其他3个基因的突变,包括NBAS、WNT10A及HFE。但查阅文献后,我们发现只有KCNH2基因突变与晕厥及LQTS的临床表现相关。NBAS基因突变会导致一种罕见的复杂综合征,其改变主要表现在肝脏、骨骼、皮肤、免疫及神经系统[22]。WNT10A及HFE基因与多种外胚层疾病相关,主要影响皮肤、牙齿及血色素沉着[23]。这些结果都表明,KCNH2的移码突变c.3100＿3109delGACACGGAGC[p.(Pro1034Thrfs∗20)]是可能导致LQTS发生的致病性突变。

KCNH2通道是一个四聚体蛋白,包含有4个亚单位[24]。每个亚单位由6个α螺旋跨膜单位组成(S1～S6),连接S5及S6的胞内肽段共同构成通道孔的结构域。跨膜单位分为氨基端(C端)和羧基端(N端)。KCNH2的N端具有Per-Arnt-Sim(PAS)结构域(1～135位氨基酸),其C端包含有一个环核苷酸结合同源(CNBH)结构域(750～870位氨基酸);CNBH结构域与通道孔相连,并且与PAS结构域相互作用[25]。前期研究表明位于通道孔及PAS结构域的突变临床症状更为严重,如恶性心脏事件的发生概率更高[26]。而发生在PAS、通道孔及CNBH结构域的基因突变导致功能缺失最常见的机制是通道蛋白运输异常[9]。然而本研究中,KCNH2的突变位于PAS、通道孔及CNBH结构域外,靠近C端。KapplingerJD等[27]发现约半数的KCNH2突变位于上述3个区域外,靠近N端或C端。TesterDJ等[13],LieveKV等[28]发现了相似的结果,并且KCNH2突变的位置与临床表型的严重程度无关,这与我们的研究结果是一致的。此外,在TesterDJ等[13]的研究中检测出的移码突变(c.3101-3108del,c.3102-3111del及c.3107del)与本研究发现的突变位点位置相近。这些结果表明,本例患儿临床症状的严重程度与突变的位置无关。另有研究证实KCNH2无义突变或移码突变时会产生截短蛋白导致通道运输功能障碍[29]。GongQ等[30]发现R1014X突变使KCNH2蛋白的C端截短造成通道运输异常,并出现严重的临床表现。与本例患儿相关的Pro1034Thrfs突变位于卷曲结构域,极为靠近R1014X突变,同样导致了蛋白的截短。此外,本病例表现出了较为严重的临床表型,这表明蛋白截短可能在LQTS的发病中起到了重要作用。然而,MigdalovichD等[31]报道无论突变位于何种位置,女性都更易出现致命性心脏事件。本例患儿表现出了与前期研究一致的临床症状,但确切的机制仍需进一步研究。

4、总结

先证者及其母亲都为KCNH2杂合突变(Pro1034Thrfs∗20),表明KCNH2突变是LQTS的致病突变。因此,对KCNH2进行筛查对于LQTS的诊断及治疗至关重要。系统分析的进步可以提高对于LQTS的理解并对LQTS的治疗管理有重要贡献。

基金资助:国家自然科学基金项目,编号82170518;

文章来源:林舒嘉,陈顺,林秋萍等.1例KCNH2基因突变致长QT综合征病例分析[J].儿科药学杂志,2023,29(12):38-43.