冬凌草甲素(oridonin)是从植物冬凌草中提取的四环二萜类化合物，具有较强的抗肿瘤、抗菌和抗突变的作用[1]。本研究将冬凌草甲素作用于人肝癌BEL-7402/5-FU细胞，探讨冬凌草甲素对其细胞周期、诱导细胞凋亡及相关信号通路的影响。

1、材料

1.1细胞株及药物

人肝癌细胞株Bel-7402:中科院上海细胞库。冬凌草甲素(Oridonin, CAS:28957-04-2)(纯度≥99%):成都普思生物科技股份有限公司。5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil, 5-FU):碧云天生物技术公司，批号：050821210811。

1.2主要试剂及仪器

CCK-8:Apexbio公司，批号：K101819133EF5E;YAP、TAZ引物：生工生物工程(上海)股份有限公司；荧光定量PCR试剂盒：TaKaRa公司，批号：AK31128A;Cyclin D1、CTGF、Survivin、Bcl-2、GAPDH兔多克隆抗体：杭州戴格生物技术有限公司；细胞凋亡检测试剂盒：江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20220125;细胞周期检测试剂盒：江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20220221。DFC 7000T型倒置显微镜：德国Leica公司；Power Wave XS型全波长酶标仪：Gene Company Limited; Cytoflex型流式细胞仪：Beckman公司；Step One Plus荧光定量PCR仪：ABI公司。

2、方法

2.1人肝癌BEL-7402/5-FU耐药细胞株的建立

人肝癌Bel-7402细胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置37℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击的诱导方法，用含0.1μmol /L 5-FU的培养液，低浓度持续诱导3～5 d,弃上清，加入新鲜培养液培养，当细胞恢复生长后，加入含10μmol /L 5-FU的培养液进行大剂量冲击诱导，待存活细胞恢复增殖后，加入含1μmol /L 5-FU的培养液继续诱导，直至细胞能在该浓度下增殖。根据以上方法反复诱导， 当细胞能在含50μmol /L 5-FU的培养液中存活时， 即为人肝癌BEL-7402/5-FU耐药细胞株。

2.2 CCK-8法检测冬凌草甲素对Bel-7402/5-FU细胞增殖的影响

取对数生长期的BEL-7402/5-FU细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL,接种于96孔板中，每孔100μL,置37℃、5% CO2培养箱中培养24 h加药，分组如下：①空白对照组：不加任何药物处理；②冬凌草甲素组：加入终浓度为4、8、16、32、64μmol/L的冬凌草甲素；③5-FU组：加入浓度为含200μmol/L的5-FU;④冬凌草甲素+5-FU组：先加200μmol/L的5-FU,再加入上述不同浓度的冬凌草甲素。实验设6个复孔，分别于24 h、48 h、72 h结束培养，并加入CCK-8试剂，37℃孵育2 h,培养液调零，450 nm处测量吸光度(A)值，计算细胞生长抑制率(inhibition rate, IR)。IR=(1-实验孔A值/对照组A值)×100%。确定最适逆转浓度：以BEL-7402/5-FU细胞抑制率≤10%为最适逆转浓度。

2.3 CCK-8法测定细胞耐药逆转指数

选择BEL-7402/5-FU细胞抑制率≤10%的非毒性剂量作为最适逆转浓度，即4μmol /L冬凌草甲素作用24 h,联合5-FU进行耐药逆转实验。 取对数生长期的BEL-7402/5-FU细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL,接种于96孔板中，每孔100μL,置37℃、5% CO2培养箱中培养24 h加药，分组如下：①空白对照组：不加任何药物处理；②5-FU组：加入终浓度分别为50、100、200、400、800μmol/L的5-FU;③冬凌草甲素+5-FU组：上述不同浓度的5-FU组加入最终浓度为4μmol /L的冬凌草甲素。于24 h结束培养，并加入CCK-8试剂，37℃孵育2 h,培养液调零，450 nm处测量吸光度(A)值，计算IR和半数抑制浓度(IC50),并计算细胞耐药逆转指数(reversal index, RI)。RI=抗肿瘤药物IC50/抗肿瘤药物联合逆转药物IC50。

2.4流式细胞仪检测冬凌草甲素对Bel-7402/5-FU细胞凋亡的影响

取对数生长期的BEL-7402/5-FU细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL,接种于6孔板中，每孔2.5 mL,置37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后加药，分组如下：①空白对照组：不加任何药物处理；②冬凌草甲素组：加入终浓度为16μmol /L的冬凌草甲素；③5-FU组：加入终浓度200μmol/L的5-FU;④冬凌草甲素+5-FU组：加入200μmol/L的5-FU,再加入16μmol /L的冬凌草甲素，每组设3个复孔，继续培养24 h后，按照试剂盒操作说明，收集各组细胞，PBS洗涤后，用500μL Binding Buffer悬浮细胞，加入5μL AnnexinⅤ-FITC混匀后，加入5μL PI混匀，室温避光反应5～15 min,上流式细胞仪检测。

2.5流式细胞仪检测冬凌草甲素对Bel-7402/5-FU细胞周期的影响

细胞分组与处理同2.4,按照试剂盒操作说明，收集各组细胞，PBS洗涤后调整细胞浓度至1×106个/mL,离心去上清，加入体积分数为70%的冷乙醇500μL4℃固定过夜，染色前用PBS洗去固定液，加入500μL PI/RNase A染色工作液，室温避光30～60 min,上流式细胞仪检测。

2.6实时荧光定量PCR法检测各组细胞YAP、TAZ的mRNA表达水平

细胞分组与处理同2.4,收集细胞用于提取总RNA。用Trizol法提取总RNA,按照试剂盒说明进行逆转录反应和Real-time PCR检测。逆转录反应条件：37℃15 min, 85℃5 s, 4℃保存。PCR反应条件：95℃,30 s; 95℃,5 s, 60℃,30 s, 40个循环；熔解曲线95℃,15 s, 60℃,60 s, 95℃,15 s。YAP上游引物5’-CAGAACCGTTTCCCAGACTACCTTG-3’,下游引物5’-GCAGACTTGGCATC AGCTCCTC-3’;TAZ上游引物5’-ATCACCAACACCAGCAGCAGATG-3’,下游引物5’-TGGATTCTCTGAAGCCGCAGTTTC-3’;内参EF-1α上游引物5’-CGAGC CACCATACAGTCAGA-3’,下游引物5’-CCATTCCAACCAG AAATTGG-3’;采用相对定量分析方法(2-ΔΔCt法)进行分析。

2.7 Western Blot法检测各组细胞Cyclin D1、CTGF、Survivin、Bcl-2的蛋白表达水平

细胞分组与处理同2.4,收集细胞，用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，按照WES全自动蛋白定量分析试剂盒的操作说明，在反应板内依次加入蛋白样品3μL·孔-1,抗体稀释液10μL·孔-1,兔抗人Cyclin D1抗体、CTGF抗体、Survivin抗体、Bcl-2抗体(一抗，1∶20稀释)10μL·孔-1,兔抗人GAPDH抗体(内参，1∶100稀释)10μL·孔-1,HRP标记山羊抗兔IgG抗体(二抗)10μL·孔-1,发光液15μL·孔-1,清洗缓冲液500μL·孔-1,用WES全自动蛋白定量分析仪进行检测，并用Compass软件进行峰面积(Peak area, PA)的分析，蛋白相对表达水平用PA目标蛋白/PA内参蛋白比值表示。

2.8统计学方法

各组数据用(x¯±s)表示，多组间均数比较采用方差分析，所有数据均由SPSS 19.0统计软件进行处理，P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1冬凌草甲素对Bel-7402/5-FU细胞增殖的影响

见表1。

表1各组Bel-7402/5-FU细胞增殖抑制作用比较(x¯±s)

3.2冬凌草甲素对Bel-7402/5-FU细胞耐药逆转指数

与5-FU组(722.173±97.391)μmol /L相比，冬凌草甲素和5-FU合用组(363.954±26.153)μmol /L的IC50显著降低(P<0.01),计算其对BEL-7402/5-FU细胞耐药逆转指数为1.984。

3.3冬凌草甲素对Bel-7402/5-FU细胞凋亡的影响

见图1,表2。

表2各组Bel-7402/5-FU细胞凋亡的比较(x¯±s,%)

图1各组Bel-7402/5-FU细胞凋亡的比较   

3.4冬凌草甲素对Bel-7402/5-FU细胞周期的影响

见图2,表3。

3.5冬凌草甲素对Bel-7402/5-FU细胞YAP、TAZ mRNA表达的影响

见表4。由表4可见，与空白对照组相比，合用组的YAP mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。与空白对照组相比，5-FU组和合用组的TAZ mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。

表3各组Bel-7402/5-FU细胞周期的比较(x¯±s,%)

图2各组Bel-7402/5-FU细胞周期的比较   

表4各组细胞YAP、TAZ mRNA相对表达量(x¯±s)

3.6冬凌草甲素对Bel-7402/5-FU细胞Cyclin D1、CTGF、Survivin、Bcl-2蛋白表达的影响

见图3。由图3可见，各组细胞Cyclin D1、CTGF的蛋白相对表达量无显著性差异。与空白对照组相比，5-FU组和合用组的Survivin蛋白相对表达量显著降低(P<0.01);与冬凌草甲素组相比，5-FU组和合用组的Survivin蛋白相对表达量显著降低(P<0.01);与5-FU组相比，合用组的Survivin蛋白相对表达量显著降低(P<0.01)。与空白对照组相比，5-FU组和合用组的Bcl-2蛋白相对表达量显著降低(P<0.01);与冬凌草甲素组相比，5-FU组和合用组的Bcl-2蛋白相对表达量显著降低(P<0.01);与5-FU组相比，合用组的Survivin蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。

图3各组Bel-7402/5-FU细胞Cyclin D1、CTGF、Survivin、Bcl-2蛋白表达的Western Blot检测结果及相对表达量比较  

4、讨论

早期手术切除是肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者首选的治疗方法，但患者就诊时往往已进入中晚期，失去了最佳手术时机。化疗是肝癌治疗的最重要手段之一，5-Fu目前仍然是肝癌化疗的主要药物，耐药是目前治疗最大的障碍[2]。肝癌的发生、发展及肿瘤耐药和Hippo信号通路失调密切相关。Hippo信号通路中主要效应分子YAP/TAZ属于癌基因[3]。Hippo信号通路的核心作用是失活主要效应分子YAP/TAZ,阻断增殖相关基因Cylin D1、CTGF以及凋亡抑制基因Survivin、Bcl-2的表达[4]。近年来，中药及其提取物抗肿瘤化疗耐药机制的研究日益增多。冬凌草又名延命草，据《药典》记载，冬凌草具有清热解毒、健胃活血、消炎止痛和抗肿瘤等功效[5]。课题组前期研究中，笔者发现冬凌草甲素能抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制其迁移能力，这与其抑制Wnt/β-catenin信号通路，上调E-cad蛋白、降低Vimentin蛋白表达有关[6,7]。本项目从Hippo信号通路研究冬凌草甲素逆转肝癌化疗耐药。

体外实验研究证实，用5-FU培养液进行大剂量冲击反复诱导，首先确定人肝癌BEL-7402/5-FU耐药细胞株的建立(即细胞能在含50μmol/L5-FU的培养液中存活)。选择BEL-7402/5-FU细胞抑制率≤10%的非毒性剂量作为最适逆转浓度(即4μmol /L冬凌草甲素作用24 h)用于后续实验。CCK-8法测定细胞耐药逆转指数，与5-FU组相比，冬凌草甲素和5-FU合用组的IC50显著降低(P<0.01),计算其对BEL-7402/5-FU细胞耐药逆转指数为1.984。在此基础上，课题组进一步研究冬凌草甲素对Bel-7402/5-FU细胞凋亡、周期以及YAP、TAZ的mRNA表达和Cyclin Dl、CTGF、Survivin、Bcl-2蛋白表达的影响。

细胞凋亡是细胞在正常生理或病理状态下发生的一种由基因控制的自发的程序性死亡过程。许多抗癌药物都可以通过激活肿瘤细胞凋亡通路而达到抑制肿瘤生长的目的[8]。研究表明，肿瘤细胞的耐药性与肿瘤的凋亡机制障碍关系密切，肿瘤细胞能通过凋亡逃逸而介导肿瘤细胞产生耐药性[9]。本实验研究表明，冬凌草甲素联合5-FU作用于Bel-7402/5-FU细胞，相对于5-FU单药，能明显促进5-FU对Bel-7402/5-FU细胞凋亡，表明冬凌草甲素和5-FU合用能重新激活Bel-7402/5-FU细胞凋亡通路。

肿瘤发生被认为是一种细胞周期相关疾病。正常情况下，细胞周期是严格按照顺序进行的，但是当细胞的DNA受到损伤后，细胞周期可能发生停滞。本实验研究表明，与5-FU组相比，合用组的G2期细胞比例显著增加(P<0.01),表明冬凌草甲素和5-FU合用可将BEL-7402/5-FU细胞阻滞在G2期。通过实时荧光定量PCR法，进一步检测到冬凌草甲素和5-FU合用组YAP mRNA和TAZ mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。Western Blot法检测各组细胞Cyclin Dl、CTGF的蛋白相对表达量无显著性差异；合用组的Survivin、Bcl-2蛋白相对表达量显著降低(P<0.05或P<0.01)。

综上，本研究结果显示，冬凌草甲素可逆转肿瘤化疗耐药，影响细胞增殖、凋亡和细胞周期，其机制可能与干预Hippo信号通路有关。

参考文献:

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药技术出版社,2015.

[6]叶兴涛,徐永亦,施航,等.冬凌草甲素对人肝癌SMMC-7721细胞增殖侵袭的抑制作用及细胞Wnt2/3-catenin表达的影响.[J].中华中医药学刊,2019,37(3):684-687.

[7]史国军,叶兴涛,屠小龙,等.冬凌草甲素对肝癌细胞增殖的抑制作用及其对E-cadherin､Vimentin表达的影响[J].中国中医药科技,2019,26(4):526-529.

[8]侯晓莹,杜鸿志,袁胜涛.基于能量代谢的抗肿瘤药物研究进展[J].肿瘤防治研究,2017,44(3):231-235.

基金资助:浙江省宁波市自然科学基金项目(202003N4216); 浙江省宁波市自然科学基金项目(2021J305);第四轮省级重点学科“十二五”中西医结合肿瘤学,第五批全国中医临床优秀人才研修项目(国中医药人教函[2022]1号);

文章来源:史国军,王永生,何国浓等.冬凌草甲素对肝癌BEL-7402/5-FU细胞增殖､凋亡､细胞周期及Hippo信号通路的影响[J].中国中医药科技,2023,30(04):666-670.