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GSDMD对肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭能力的探究

2020-06-04 3048 上传者：管理员

摘要：探讨GSDMD对肺癌细胞A549生物学表型的影响。方法:利用肺癌组织芯片,通过免疫组化的方法检测了肺癌组织中GSDMD的蛋白表达;利用慢病毒转染技术,分别下调和上调了A549细胞中GSDMD的表达,并通过一系列体外功能试验,探索了GSDMD下调和上调对肺癌细胞A549生物学表型的影响。结果:免疫组化结果提示:GSDMD在肺癌组织中的高表达高于癌旁正常组织,且其主要定位于肺癌的细胞质。利用慢病毒转染技术,构建了稳定下调和上调GSDMD的细胞系A549-siGSDMD和A549-LV-GSDMD。BrdU细胞增殖及CCK8实验表明:下调GSDMD的表达抑制了A549细胞的增殖能力,反之亦然;高内涵细胞运动试验证实:下调GSDMD的表达抑制了A549细胞的运动能力,反之亦然;Transwell迁移和侵袭试验表明:下调GSDMD的表达,抑制了A549细胞的迁移和侵袭能力,而上调GSDMD的表达,则得到了相反的结果。结论:GSDMD促进了肺癌细胞A549的增殖、迁移和侵袭能力。

关键词：
GSDMD
侵袭
增殖
肺癌
肺肿瘤
迁移
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肺癌是导致癌症相关死亡的一个主要原因,全世界每年约有159万人死于肺癌。在中国,2015年肺癌相关死亡约占所有癌症相关死亡的21.6%[1]。肺癌主要包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌,前者在组织学上又可分为肺腺癌和肺鳞状细胞癌[2]。

GSDMD属于结构上和进化上保守的GSDM蛋白超家族,其功能尚不清楚[3]。2015年,两项独立的研究均证实:GSDMD是介导焦亡发生的关键执行者[4,5]。焦亡是一种溶解性、炎症性的程序性细胞死亡,以细胞肿胀和溶解为特征,同时伴有细胞内各种物质的释放,比如促炎介质lL-1β和IL-18[5]。进一步证实:多个炎症性的半胱天冬酶(caspase),包括caspase-1、caspase-4、caspase-5和caspase-11,能够将GSDMD剪切为一个32kDa大小的GSDMDN端结构域(GSDMD-N)和一个22kDa大小的C端结构域(GSDMD-C),而GSDMD-N能够在细胞膜上打孔,从而使细胞发生溶解,产生焦亡[6,7]。然而,截至目前,有关GSDMD在肿瘤中的作用及分子机制仍知之甚少。那么,GSDMD在肺癌的发生发展中究竟扮演着怎样的角色,其对肺癌生物学表型究竟起到促进作用,还是抑制作用呢?为了阐明这个问题,本研究首先通过免疫组化的方法检测了肺癌组织中GSDMD的蛋白表达,然后利用慢病毒转染技术,构建了稳定下调和上调GSDMD的稳转细胞系;最后,通过一系列体外功能试验探索了GSDMD下调和上调对肺癌细胞A549生物学表型的影响。

1、材料与方法

1.1材料

肺癌组织芯片(上海芯超生物科技有限公司;1张包含90对肺癌及相应癌旁正常组织的芯片);肺癌细胞系A549及GSDMD干扰和过表达病毒(上海吉凯公司);0.25%胰蛋白酶、DMEM培养液、Opti-MEM培养液、胎牛血清和青霉素-链霉素(Gibco公司);GSDMD引物、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和SYBRPremixExTaqTMII(Takara公司);GSDMD抗体(Sigma公司);HiPerFect转染试剂(QIAGEN公司);BrdU细胞增殖检测试剂盒(Millipore公司);CCK8试剂盒(日本DOJINDO);Transwell小室(Millipore公司);Matrigel基质胶(BD公司);4%多聚甲醛(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);结晶紫溶液(西安国安生物科技有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养和慢病毒转染

在37℃、5%CO2的培养箱中,利用DMEM培养液(含10%胎牛血清,1%青霉素-链霉素)常规培养A549细胞。慢病毒转染的具体步骤参照吉凯公司提供的操作手册,此处不具体赘述。通过RT-PCR和Westernblot检测GSDMD的转染效率。

1.2.2实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)

参考RNA提取试剂盒中的实验步骤进行组织和细胞系RNA的提取,参考反转录试剂盒中提供的体系将RNA反转录成cDNA,利用RT-PCR检测GSDMDmRNA的表达水平,以β-actin为内参,采用2-△△CT法进行相对定量分析。RT-PCR反应条件为:95℃10s,60℃30s,72℃30s,40个循环。引物序列如下:GSDMD:正引物:5'-TGAATGTGTACTCGCTGAGTGTGG-3',反引物:5'-CAGCTGCTGCAGGACTTTGTG-3';β-actin:正引物:5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3',反引物:5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。

1.2.3蛋白质的提取

①倒出培养液,用无菌的1×PBS洗三次;②加入适量的裂解液(RAPI,蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂按一定比例配制而成),充分摇晃使其接触细胞,然后用细胞刮刮下,移液枪移入1.5mlEP管,冰上裂解15min(如果提取组织蛋白,则将配制好的裂解液加入到放有组织块和小钢珠的2mlEP管中,然后在组织匀浆机打碎,12000r/min离心10min即可进行步骤⑤及后续步骤);③用超声打碎细胞(5s×3次,间隔15s);④4℃离心机(提前预冷),12000r/min离心10min;⑤吸取上清液,移入新的1.5mlEP管中,加入1/5体积的5×LoadingBuffer;⑥100℃加热10min,12000r/min离心后,稍微冷却,放入-20℃冰箱保存备用;⑦蛋白浓度的测定:将96孔板放入VARIOSKANFLASH仪器中进行测定,每孔体系为220μl,分为实验组和空白对照组;实验组体系为2μl的蛋白样品+18μl的PBS+200μl的G250染色液;空白对照组体系为20μl的PBS+200μl的G250染色液。

1.2.4Westernblot

℃冰箱内取出提前准备好的蛋白样品,融化混匀后上样;组装好电泳装置,设定好条件(习惯采用恒流),接通电源后开始电泳,待蓝色线条移动到相应位置(具体位置依所需蛋白分子量而定)时,结束电泳;裁剪PVDF膜和滤纸,切胶,注意胶、膜和滤纸三者的大小;注意PVDF膜在使用前需要在甲醇中浸泡一会;转膜:湿转,恒流300mA,至少1h(具体选择依据所需蛋白分子量而定);丽春红染色,30s即可,观看膜上有无条带以确认转膜是否成功;用5%的脱脂牛奶(1×TBST配制而成)孵育,室温1h即可;一抗稀释液,配制好所需一抗后进行孵育,置于4℃冰箱摇床上,过夜;次日取出后,室温下进行复温,约1h,然后用1×TBST洗膜,每次5min,洗3遍(摇床设定80r/min);二抗(5%脱脂牛奶和1×TBST等体积配制)孵育,室温下1h即可;用1×TBST洗膜,每次5min,洗3遍;按1∶1比例配制适量的发光液(尽量现配现用);用MolecularImagerChemiDocTMXRSimagingSystem仪器进行显影。本实验所用相关抗体信息描述如下:一抗:GSDMD抗体(Sigma公司,兔抗);β-actin(Sigma公司,鼠抗);二抗:山羊抗兔IgG,山羊抗鼠IgG(中杉金桥)。

1.2.5BrdU细胞增殖及CCK8实验

根据BrdU细胞增殖检测试剂盒以及CCK8试剂盒的操作说明进行相关实验。

1.2.6高内涵细胞运动实验

细胞转染24h后,常规消化处理,然后取适量细胞(细胞密度约为40%～50%)接种于12孔板;次日,待细胞贴壁后,做如下处理:弃去孔内培养液,DMEM基础培养液洗3遍,然后加入Hoechst稀释液(1∶1000,用DMEM基础培养液配制)2ml,于37℃、5%CO2的培养箱中孵育15～30min,再用DMEM基础培养液洗3遍,用1ml注射器吸净孔内残存的液体,最后加入DMEM完全培养液;将12孔板移入CELLOMICSARRAYSCANVTIHCSReader仪器中,设定程序,监测12h;将数据从仪器中输出,进行数据分析处理(绘制图形)及统计学分析。

1.2.7Transwell迁移和侵袭实验

①在超净台内将Transwell小室取出,放于24孔板的孔内,并向小室外部,即孔内加入600μl左右的含有20%胎牛血清的培养液,暂时放入培养箱内;②对细胞进行常规消化处理,800r/min离心5min后,用基础培养液重悬,然后进行细胞计数;③根据细胞计数结果,计算所需加入的细胞量(一般为每200μl5×104个细胞);④取出步骤①中准备好的24孔板,给Transwell小室的上室内加入200μl细胞悬液(每组细胞设置3个复孔),重新放回培养箱内,24h后(可适当调整时间)取出;⑤用4%多聚甲醛进行固定,15min即可;⑥用棉签轻轻擦拭小室的膜内侧,反转晾干;⑦用结晶紫溶液(0.5%)进行染色,15min即可;⑧用1×PBS洗小室,5min×3次,反转晾干;⑨在显微镜下观察拍照;⑩统计学分析:随机挑选10个视野/样本,进行细胞计数,然后计算平均值即可。

侵袭实验:实验前一天,把Matrigel放入4℃冰箱,过夜使其变成液体状态备用;Matrigel与基础培养液以1∶8的比例配制(在冰上进行操作),然后取100μl加入Transwell小室的上室内,放于培养箱中,静置使其凝结成胶;余步骤同迁移实验。

1.2.8免疫组织化学

免疫组织化学的方法具体参见以前发表的文献[8],在此不做赘述。本实验所用相关抗体信息描述如下:一抗:GSDMD抗体(Sigma公司,兔抗);二抗:生物素化二抗工作液(SP-9001:生物素标记山羊抗兔IgG)(中杉金桥)。

1.3统计学方法

实验结果以均数±标准误(x¯±s)(x¯±s)表示,采用t检验进行分析;统计学分析软件采用SPSS22.0,当P<0.05时,差异被认为具有统计学意义。

2、结果

2.1通过免疫组化的方法检测肺癌组织中GSDMD的表达

首先,我们通过免疫组化的方法,在肺癌组织芯片中检测了GSDMD的表达,结果发现:GSDMD在肺癌组织中的高表达(67/88,76.14%)明显高于癌旁正常组织(30/88,34.10%),差异具有统计学意义(表1)。此外,我们还发现,GSDMD主要定位于肺癌组织的细胞质中(图1)。

表1GSDMD在肺癌组织及癌旁正常组织中的表达

图1GSDMD在肺癌组织和癌旁正常组织中的表达(免疫组化染色)

2.2利用慢病毒转染技术下调或上调肺癌细胞A549中GSDMD的表达

为了研究GSDMD在肺癌中的作用,我们分别将GSDMD干扰及过表达病毒转入A549细胞,RT-PCR及Westernblot对其转染效率进行了验证,结果显示:相比于对照细胞(A549-siNC),转染了干扰病毒的细胞(A549-siGSDMD)GSDMDmRNA及蛋白表达均降低;转染了过表达病毒的细胞(A549-LV-GSDMD)GSDMDmRNA及蛋白表达则明显高于对照细胞(A549-LV-NC),见图2。

图2肺癌细胞A549转染GSDMD干扰及过表达病毒后GSDMD的相对表达水平的验证

2.3GSDMD下调或上调对肺癌细胞A549增殖能力的影响

BrdU细胞增殖及CCK8实验的结果显示:与A549-siNC细胞相比,A549-siGSDMD细胞的增殖能力明显下降;而与A549-LV-NC细胞相比,A549-LV-GSDMD细胞的增殖能力则明显增加(图3)。

图3下调或上调肺癌细胞A549中GSDMD的表达对细胞增殖能力的影响

2.4GSDMD下调或上调对肺癌细胞A549运动能力的影响

高内涵细胞运动试验结果显示:A549-siGSDMD细胞的运动能力比A549-siNC细胞的运动能力弱;而A549-LV-GSDMD细胞的运动能力比A549-LV-NC细胞的运动能力强(图4)。

2.5GSDMD下调或上调对肺癌细胞A549迁移和侵袭能力的影响

Transwell迁移和侵袭试验结果显示:相比于A549-siNC细胞,A549-siGSDMD细胞的迁移和侵袭能力明显降低;而相比于A549-LV-NC细胞,A549-LV-GSDMD细胞的迁移和侵袭能力则明显升高(图5)。

3、讨论

肺癌是世界范围内肿瘤相关死亡最常见的原因之一[9]。值得注意的一点是:大多数患者诊断时已是肺癌晚期,尤其是在Ⅳ期[9]。虽然不同的治疗方法,包括化疗、放疗、手术等在一定程度上提高了肺癌患者的生存率,但不可避免的转移仍然是肺癌治疗的一大挑战[10,11]。因此,我们需要寻找新的有效的生物学标志及潜在的治疗靶点。

图4下调或上调肺癌细胞A549中GSDMD的表达对细胞运动能力的影响

图5下调或上调肺癌细胞A549中GSDMD的表达对细胞迁移和侵袭能力的影响(结晶紫染色×400)

焦亡是一种促炎性的细胞死亡方式,已有研究证实:有一类被称为炎性体的多蛋白复合物在其中发挥重要作用。其中,权威炎性体主要通过半胱天冬酶(caspase)-1来介导焦亡的发生,而非权威炎性体则主要通过caspase-4和caspase-5(人类)以及caspase-11(小鼠)来介导焦亡的发生。GSDMD是一种最近被阐述的新的焦亡执行者,它能够被炎症性的caspases,包括caspase-1、caspase-4、caspase-5和caspase-11,剪切为GSDMD-N和GSDMD-C,前者则是直接介导焦亡发生的功能性片段[12]。GSDMD-N可以与细胞膜上的脂质、磷酸肌醇和心磷脂蛋白结合,继而在膜上形成孔洞,细胞内容物释出,发生焦亡[13]。

GSDMD属于GSDM蛋白超家族的一员,在人类,这个家族还包括5个成员,依次是GSDMA、GSDMB、GSDMC、DFNA5和DFNB59,而它们已经被证实在多种类型的肿瘤中发挥重要作用[14,15]。比如,GSDMB能够促进乳腺癌的侵袭与转移[16],GSDMC促进结直肠癌细胞的增殖[17],GSDME介导了caspase-3依赖的细胞焦亡,从而促进了胃癌耐药的发生[18,19]。此外,GSDMD也被证实在胃癌的增殖过程中发挥负性调控作用[20]。那么,GSDMD在肺癌的发生发展中究竟发挥着怎样的作用?

为了阐明上述问题,本实验首先利用肺癌组织芯片,通过免疫组化的方法检测了肺癌组织中GSDMD的蛋白表达,结果表明:GSDMD在肺癌组织中的高表达高于癌旁正常组织,差异具有统计学意义;然后,我们利用慢病毒转染技术,构建了稳定下调和上调的肺癌细胞系A549-siGSDMD和A549-LV-GSDMD;最后,我们进行了一系列体外功能试验,包括BrdU细胞增殖及CCK8实验、高内涵细胞运动试验和Transwell迁移和侵袭试验,结果表明:下调GSDMD的表达,抑制了A549细胞的增殖、运动、迁移和侵袭能力;反之,上调GSDMD的表达,则促进了A549细胞的增殖、运动、迁移和侵袭能力。

综上所述,GSDMD在肺癌的发生发展中起着促癌作用,这在一定上程度上提示我们:GSDMD可能作为肺癌的一个潜在的诊疗靶点。在后续研究中,一方面,我们将进一步通过体内研究证实我们的实验结果;另一方面,我们将重点探索GSDMD参与肺癌增殖与转移的潜在分子机制,并期望能够为肺癌的靶向治疗提供依据。

王莉,王萌,王亚芳,陈迪,王玉同.GSDMD对肺癌A549细胞增殖和侵袭的生物学作用[J].现代肿瘤医学,2020,28(14):2396-2400.