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谷胱甘肽过氧化物酶GPX4在铁死亡中的作用与机制研究进展

  2021-03-05    9987  上传者:管理员

摘要:谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)是一种能够特异性催化谷胱甘肽将脂质过氧化物转化为类脂醇的硒蛋白,它在调节细胞铁死亡方面发挥着重要的作用。本文将对GPX4的蛋白结构、分子作用机制及其表达调控进行介绍,对其在铁死亡中的功能以及在癌症等疾病中的应用进行系统综述,对未来存在的问题进行了分析与展望。

  • 关键词:
  • GPX4
  • 癌症
  • 肿瘤细胞
  • 脂质过氧化
  • 铁死亡
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目前,已经发现的细胞死亡方式包括凋亡、坏死、焦亡以及铁死亡。这些细胞死亡受大量的调控通路执行,相较于凋亡、坏死以及其他形式的细胞死亡,铁死亡特殊在其铁依赖性脂质活性氧(ROS)的积累[1,2]。尽管尚不知铁死亡过程是否存在像凋亡中Caspase功能的标志性调控蛋白,但已有的大量证据表明,谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathioneperoxidase4,GPX4)可作为判断细胞铁死亡的参考标志。GPX4蛋白具有清除脂质过氧化物的功能,失活GPX4导致氧化平衡被打破,脂质过氧化物破坏膜结构,激发铁死亡[3]。由于其特殊的作用机制,铁死亡核心调控子GPX4已上升为“明星分子”,本文详细综述了近些年来GPX4的结构、作用机制,表达调控以及在铁死亡中的功能等研究进展,并对铁死亡与癌症等疾病的关系进行合理分析与展望。


1、GPX4的作用机制和表达调控


1.1GPX4的结构和作用机制

GPX4又名磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)[4],是第四个含有硒元素的GPX成员。GPX4基因位于人类基因组中19p13.3的位置[5],全长GPX4基因中有七个外显子[2]。克隆结果表明它是一种多肽170个氨基酸,理论分子量为约19kDa[6]。在哺乳动物中发现了一些GPX家族成员,包括GPX1到GPX8[7]。然而,只有GPX4可以有效的清除膜脂过氧化氢产物,预防氧化应激。GPX4独特的能力取决于其特定的氨基酸序列和空间结构[8]。

GPX4的作用是将脂质氢过氧化物还原为无毒脂质醇,从而限制了脂质过氧化在膜内的传播。

GPX4蛋白的催化循环遵循在两个不同的阶段发生的乒乓机制,从而使酶的活性位点在氧化态和还原态之间穿梭。第一步涉及通过被氧化的活性位点硒代半胱氨酸还原过氧化物。第二阶段通过使用还原性底物(例如GSH)来补充活性位点残基,从而减少了活性位点残基,并且还原性底物被氧化。有趣的是,GPX4蛋白不遵循Michaelis-Menton反应动力学,并且有人认为这是因为过氧化物还原的限速步骤不是GPX4-过氧化物复合物的降解,而是过氧化物与酶活性位点的初始结合。GPX4催化了有机物的还原氢过氧化物通过将活性部位硒醇(Se-H)氧化为硒酸(Se-OH),使用GSH还原硒酸回到活性硒醇[9]。

GPX4-Se-+L-OOH→GPX4-SeOH+L-OH

GPX4-SeO-+H++GSH→GPX4-Se-SG+H2O

GPX4-Se-SG+GSH→GPX4-Se-+H+GSSG

1.2GPX4基因转录与翻译水平调控

ALIM等[10]在脑出血ICH模型中发现人体脑细胞能够自主的通过Se摄入,来调控出血引起的细胞损伤。进一步研究得出,硒激活转录协同因子SP1来上调GPX4抑制铁死亡来保护神经元。GPX4mRNA的3'非翻译区含有一个硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)元件[11]。通常翻译过程中,将UGA密码子读作终止密码子,而SECIS存在的情况下指导UGA密码子编码一个活性位点硒代半胱氨酸(U46)。这种特殊的翻译形式需要一套独特的蛋白质系统来指导硒代半胱氨酸插入到GPX4(和其他硒蛋白)中。因此,GPX4的表达受硒的可用性的调节[12]。UFERC等[13]发现,Grsf1(guanine-richsequence-bindingfactor1)能够上调GPX4的表达,探究出Grsf1是通过绑定线粒体GPX4(mGPX4)mRNA的5'非翻译区(UTR)靶序列,将其募集到翻译活性多组分中,加快其翻译速率。敲除Grsf1会抑制胚胎脑细胞中mGPX4的表达。在小鼠胚胎模型中,Grsf1和mGPX4具有相似的组织特异性分布模式,在小鼠胚胎发育过程中共同表达。多重证据表明GPX4在胚胎发育中起着重要的作用。

1.3GPX4基因翻译后调控

蛋白水平上的修饰也是维持GPX4蛋白稳定的调控方式。热休克蛋白A5(HSPA5)也称GRP78或BIP,是分子伴侣蛋白,主要在内质网上表达。HSPA5是未折叠蛋白反应的重要组成部分,在内质网应激条件下,促进细胞存活。ZHU等[14]发现,HSPA5能够与GPX4相互作用,抑制其泛素化降解,而延长其半衰期。遗憾的是,HSPA5究竟与GPX4的哪种E3泛素连接酶竞争结合位点,尚未发现。自噬是细胞对环境变化的有效反应,GPX4蛋白水平也能被自噬直接调控[15]。在GPX4的氨基酸序列内有一种酪氨酸被认为是磷酸化的,但其在控制酶活性中的作用尚不清楚[16]。翻译后调控可能将GPX4的水平和活性维持在既能预防过氧化,也能不影响重要的生理脂质信号分子的产生。


2、GPX4与铁死亡


铁死亡是近年来新发现的一种程序性死亡方式,它区别于细胞凋亡、细胞坏死,特征性的形态学表现为线粒体比正常细胞小,且膜密度增加,外膜破裂,但细胞核的形态不发生改变。铁死亡依赖于铁和ROS,其特点是脂质过氧化。

2.1半胱氨酸代谢通路的阻碍是谷胱甘肽耗竭的直接原因

Erastin是通过高通量选筛选K-RAS突变的癌细胞化疗药时,偶然发现的铁死亡诱导剂[1]。Erastin能够抑制半胱氨酸的代谢来诱导铁死亡。谷氨酸-胱氨酸反向转运体SystemXC-是由轻链亚基SLC7A11(xCT)和重链亚基SLC3A2以二硫键组成的异二聚体,能够介导细胞内谷氨酸(glutamate)和细胞外胱氨酸(cystine)进行1∶1交换[17]。胱氨酸在胞内迅速转化为半胱氨酸(L-cysteine),半胱氨酸是细胞内谷胱甘肽GSH的合成原料,Erastin抑制SystemXC-导致谷胱甘肽GSH不能合成。谷胱甘肽GSH的缺乏使细胞不能清除脂质过氧化物,造成蛋白和膜的损伤,从而发生铁死亡(图1)。

图1铁死亡机理图

2.2铁和多不饱和脂肪酸是脂质ROS生成的必要条件

一定量的游离铁是铁死亡发生的基础,铁螯合剂(如去铁胺DFO)可以降低几乎所有的脂质过氧化物,铁代谢过程与铁死亡的引发密切相关。转铁蛋白(transferrin)是铁的转运蛋白,它通过转铁蛋白受体(TFR-1)的识别将铁从细胞外环境输入细胞[18]。进入细胞内的铁离子与过氧化氢(活性氧)发生芬顿反应,导致多不饱和脂肪酸过氧化,生成脂质过氧化物,破坏细胞膜结构,最终引起细胞死亡(图1)。

多不饱和脂肪酸PUFA能够增加膜的流动性,对原始生命适应环境很重要。然而,多不饱和脂肪酸的代谢促进了铁死亡的诱导。亚铁离子与过氧化氢发生芬顿反应生成羟基自由基,羟基自由基与多不饱和脂肪酸经过多步自由基链式反应,将其变成脂质过氧化物。其中溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(LPCAT3)和酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)这两种基因在多不饱和脂肪酸代谢中起着重要的作用。LPCAT3和ACSL4两种脂质代谢调节剂分别负责膜磷脂的插入和多元不饱和脂肪重塑[19]。研究表明敲除ACSL4和LPCAT3能显著抑制铁死亡的发生[20](图1)。

2.3GPX4的失活是脂质过氧化物积累的原因

2012年DIXON等[1]发现铁死亡时,尚不清楚GPX4扮演的作用。直到2014年,研究者通过靶向代谢组学分析发现,谷胱甘肽的缺失会导致谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)的失活,进一步化学蛋白质组学策略筛选出GPX4分子。敲降或者过表达GPX4调节了12种铁死亡诱导剂的致死率,但对11种其它机制致死试剂没有影响。无疑,GPX4是铁死亡的关键调控因子[3]。GPX4可以通过其酶活性阻止脂质过氧化物的毒性,维持膜脂质双分子层的稳态。RSL3通过与GPX4的共价键结合抑制GPX4的活性,导致过氧化物的积累。RSL3处理引起的铁死亡与GPX4失活相似,进一步支持RSL3通过GPX4抑制引起的铁死亡。谷胱甘肽(GSH)是GPX4催化过氧化物转化为醇的协同因子。谷胱甘肽缺乏引起的半胱氨酸缺乏直接使GPX4失活,并导致随后的铁死亡(图1)。


3、GPX4基因与癌症


3.1GPX4在肿瘤发展中的作用

GPX4与肿瘤的发生发展密切相关。ZHANG等[21]发现,TCGA数据库中,GPX4在一些肿瘤中的表达高于正常组织,包括结肠腺癌(COAD)、肾嫌色细胞(KICH)、肾透明细胞癌(KIRP)、肺腺癌(LUAD)、前列腺癌(PRAD)、直肠腺癌(READ)、甲状腺癌(THCA)和子宫内膜癌(UCEC)。同样,在多癌症病人中,GPX4的表达普遍高于正常组织。这显示了GPX4可能是一个癌基因。GPX4与胆管癌以及肺鳞癌患者总生存率(OS)呈负相关,并且对于不同分期癌症中,GPX4的表达也与较高的癌症分期呈正相关。大量肿瘤标本测出GPX4的启动子区域存在较低的甲基化,此外发现H3K4me3和H3K27ac富集于各种类型的肿瘤细胞的GPX4上游。GPX4在肿瘤细胞中的高表达可能由低的甲基化与高的组蛋白乙酰化导致的。这些证据显示GPX4与癌症患者的预后不良密切相关。ROS被认为是重要的细胞信号分子,最新的证据表明,ROS积累与肿瘤干细胞(CSCs)的产生以及EMT的过程有关,被认为是肿瘤发生和进展的重要特征。GPX4在维持氧化稳态上发挥着重要的作用,敲除和过表达GPX4分别导致Panc1CSCs间质makers下调和上皮makers上调[22]。无疑证明了GPX4通过调控ROS而影响肿瘤EMT的过程。

3.2靶向GPX4的抗癌策略

尽管GSH的中断可能间接的使GPX4失活,但这种策略由于其他代偿途径的存在,在体内似乎不太有效。相反,直接针对GPX4的策略可能更有效的诱导体内癌细胞中的铁死亡。第一个发现的直接抑制GPX4的抑制剂是RSL3,它包含亲电性氯乙酰胺,不可逆的结合到其活性部位,导致GPX4失活。后来还发现了其他的GPX4抑制剂,包括ML162、DPI化合物(DPI包括DPI7、10、12、13、17、18和19)[23,24,25]、FIN56[26,27]和FINO2[28]。同RSL3一样,ML162和DPI化合物作用机制也通过共价结合GPX4。FIN56导致GPX4降解并耗尽其丰度。FINO2通过间接失活GPX4以及氧化铁离子,从而引发铁死亡,但其具体的作用机制尚不清楚[29]。然而现有的大多数GPX4抑制剂的药代动力学特性较差,这限制了它们的临床应用。因此,改进现有的GPX4抑制剂的药代动力学特性和开发新的生物可利用GPX4抑制剂也是必须的。近来,有两种新型试剂在体内实验中效果显著。一种通过纳米颗粒携带释放大量铁离子激发异种移植瘤发生铁死亡[30],还有通过一种半胱氨酸工程酶去除血浆半胱氨酸,也可以减少不同小鼠移植瘤模型的肿瘤生长,但是不会导致反弹[31]。这两种试剂能否造成GPX4失活以及在分子水平上脂质过氧化物如何被影响目前还不知。

3.3GPX4在肿瘤耐药性中的作用

获得性耐药阻止了癌症治疗的稳定,增加了癌症的复发率。残留癌持久细胞是经过多次化疗药物处理而幸存下来的耐药肿瘤细胞。新的证据表明,非突变耐药机制在残留癌持久细胞(cancerpersistercells)中起着重要的作用。HANGAUER等[32]通过对非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌和黑色素瘤细胞研究发现,GPX4功能的丧失导致体外选择性持久性细胞铁依赖性死亡,并在体内防止肿瘤复发。高间充质状态的癌细胞是临床分期较高的细胞,通常其间质makers,如snail、zeb1、slug等表达水平较高。高间充质的细胞对GPX4抑制敏感,进一步研究表明zeb1参与了脂质代谢相关蛋白的表达,导致脂质过氧化增多[33]。抑制GPX4,铁死亡极易发生。目前,这些不同的细胞状态究竟如何重塑细胞内代谢以及对GPX4如何改变脂质过氧化依赖性细胞死亡的敏感性,还需要深入研究其机制。LEI等[34]发现电离辐射(IR)能引起乳腺癌、纤维肉瘤、食管腺癌和肾癌发生铁死亡,通过CDX和PDX移植瘤模型发现,GPX4的靶向试剂FINs(一系列FIN化合物)能增强放疗的敏感性。敲除GPX4的人结肠癌细胞HCT116进行裸鼠成瘤实验,经多柔比星DOX处理后,与未敲除GPX4的对照组比,肿瘤质量明显减小[35]。近来也有研究证明,顺铂等经典化疗药物联合铁死亡诱导剂更易杀伤癌细胞,关键在于细胞凋亡与铁死亡能否发挥协同作用[36,37]。肿瘤耐药性一直是临床上抗癌所面临的难题,而GPX4的横空出世,给肿瘤耐药提供了新的分子靶标和治疗策略。


4、GPX4与其他疾病


经遗传获得的人类GPX4基因突变与Sedaghatian型相关腰椎间盘突出症软骨发育不良有关[38]。这是一种可能导致骨骼、心脏和大脑异常与细胞死亡增加的致命罕见疾病。缺血再灌注损伤(IRI)是由于组织中长期缺乏血液或氧气,然后再灌注新鲜血液(如中风后),过量的自由基攻击组织细胞而引起的损伤。近来的研究发现,IRI可引起小肠、睾丸、肝脏、心脏、肾脏和大脑发生铁死亡[39]。已知的铁死亡抑制剂或抑制ACSL4的表达,皆可减轻这种损伤。抑制铁死亡可以改善脑细胞存活率和神经系统预后出血性中风和创伤性脑损伤。铁死亡的重要特征包括GSH的丢失,ROS的增加,脂质过氧化,已经在阿尔茨海默病和帕金森病疾病模型中观察到,表明这些疾病与铁死亡存在潜在的联系[40]。克罗恩病(Crohn'sdisease)是与饮食有关的胃肠道炎症,MAYR等[41]发现该病患者的组织样本中GPX4活性较低以及存在脂质过氧化现象。此外,在GPX4缺失的情况下,多不饱和脂肪酸极易引起炎症反应。GPX4控制炎症反应很大程度上是通过脂质信号分子介导的。


5、小结与展望


GPX4的失活导致脂质过氧化物的积累,继而引发铁死亡。GPX4在细胞内协同谷胱甘肽将脂质过氧化物转化为非毒性的脂质醇,似乎表现为一种预防细胞代谢副产品积累的修复酶。然而,由多不饱和脂肪酸代谢而来的信号脂在信号传导方面起着重要的作用,尤其在炎症上。无疑,GPX4行使着双重功能,控制脂质过氧化物的稳态来预防细胞铁死亡以及维持正常的信号传导。铁死亡的发现,推动了癌症治疗的发展以及神经性疾病产生的新认识。大量的体外实验和少数活体研究显示其抗癌效果显著。铁死亡要想真正应用到临床上,亟需解决的问题有很多。例如,如何使铁死亡特异性在肿瘤细胞中激发,副作用与耐药性等问题的研究仍然是一片空白。GPX4作为铁死亡关键因子,能否直接作为临床上的靶标?如何解决GPX4抑制剂的药代动力学差等难题?总之,以GPX4为靶标的铁死亡疗法势必成为未来疾病预防诊断以及治疗的新策略,真正的完善还需要更多的研究。


程峰,张庸,王祥,窦晋涛,吴志浩.谷胱甘肽过氧化物酶GPX4在铁死亡中的作用与机制研究进展[J].现代肿瘤医学,2021,29(07):1254-1258.

基金:国家自然科学基金面上项目(编号:81872371);安徽省自然科学基金面上项目(编号:1708085MH203);分子肿瘤学国家重点实验室开放课题(编号:SKL-KF-2019-11)

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