随着中医药在全球广泛使用，中药不良反应/事件时有报道，特别是部分传统被认为无毒的中药被发现可能有肝损伤风险，为中药新药研发及临床安全用药等方面带来了重大挑战[1,2,3]。科学评价中药肝损伤风险已成为中药安全性研究领域最具挑战性的问题之一。既往多认为中药肝毒性是固有毒性，然而随着研究的深入，间接毒性引起研究者的关注。间接毒性主要是生物活性物质（药效成分或其代谢产物等）通过药理活性作用引起，并与第三因素（如基础疾病、病证状态、环境因素等）密切相关，在正常动物模型上通常难以复制[4]。由于中药复方用药环境本身的复杂性，复方中潜在的有肝损伤风险的中药很难快速、精准地通过实验研究被识别出。而计算机辅助筛选具有周期短、成本低、高通量等优势，有望为复方用药条件下间接肝损伤风险中药的预测提供有力的技术支撑。

近年来，本团队致力于传统“无毒”中药的安全性评价与风险防控策略研究，发现机体免疫活化与中药肝损伤相关[5,6,7]。相关实验利用免疫介导的特异质肝损伤模型评价何首乌、补骨脂、淫羊藿等中药的肝损伤，发现以上中药在机体免疫异常活化下会诱发肝损伤[8,9]。据此，本研究以免疫活化的重要通路——核因子κB (NF-κB）通路为例，模拟间接肝损伤的条件模式，以目前肝损伤报道较多的补骨脂制剂为研究对象，探索构建复方用药条件下中药间接毒性肝损伤风险预测模式，以期为基于间接毒性认知的中药肝损伤评价研究提供新的思路及方法。

1、资料来源

本研究采用的中药肝损伤相关安全性数据主要来源于：1）国家药品监督管理局（https：//www.nmpa.gov.cn/）2022年1月1日前已警示通报的制剂；2）中草药肝损伤云系统（hilicloud.cn）收集的2012年1月1日至2016年12月31日期间收录的报告发生肝损伤的制剂；3）以“药物性肝损伤、药源性肝损伤、中药相关肝损伤、肝毒性、肝功能异常、肝衰竭、转氨酶、liver injury、liver toxicity、hepatic toxicity、hepatitis、liver dysfunction、abnormal liver function、liver failure、liver diseases、transaminase”为主题词，在中国知网、维普中文科技期刊、万方期刊数据库、Pub Med、sci-Hub、外文医学信息检索平台中检索自各数据库建库至2021年7月31日的补骨脂制剂或何首乌制剂的相关文献。

2、方法

2.1处方中药的规范化处理

将采用上述检索方式得到的制剂拆方，并参考《中华人民共和国药典》[10]规范中药名称。

2.2通路的选择及风险规则的设定

课题组前期研究提出了中药免疫特异质肝损伤“三因致毒”机制假说，强调中药的毒性是免疫应激状态引起[11]。脂多糖（LPS）模型能较好地模拟免疫应激状态，并且有多项研究发现LPS与白细胞分化抗原14 (CD14）、TOLL样受体4 (TLR4）等细胞表面受体相互作用，通过诱导NF-κB通路激活，刺激单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等释放大量细胞因子和炎症介质，如白细胞介素6 (IL-6）、肿瘤坏死因子α(TNF-α），产生一系列炎症反应和肝损伤[12,13,14,15]。前期评价补骨脂协同淫羊藿致肝损伤的实验研究[5]显示，TNF-α、IL-6等细胞因子表达与该研究中LPS诱导的肝损伤动物模型肝损伤的发生呈正相关，提示NF-κB通路被激活，还发现TNF-α为免疫与代谢的交叉点，可见NF-κB通路的激活是机体炎症反应或肝损伤的关键通路之一。因此，本研究以NF-κB通路为例，以中药与NF-κB通路之间“关联强度值”和“风险值”的大小作为该药是否存在潜在间接肝损伤风险的判定要素。具体判定方法为以每味中药作用到NF-κB通路的成分数与该中药总成分数的比值为“关联强度值”，比值越大提示中药对NF-κB通路的影响越大。同时，以每味中药正调控NF-κB通路的靶点数与该中药调控NF-κB通路靶点数的比值定义为“风险值”，比值越大提示中药发生潜在间接肝损伤的风险越大。结合了统计学及建模过程中的经验，当中药的“关联强度值”与“风险值”同时大于各自中位数时，认为该中药为具有潜在间接肝损伤的风险药物。

2.3间接肝损伤中药风险预测模式的建立

2.3.1间接肝损伤风险中药的初步筛选

从3种资料来源中获取的补骨脂制剂，参考2.1对处方中药进行规范化处理后，筛选与补骨脂配伍频次≥2的中药，分别得到中药集1、中药集2和中药集3。再对3个中药集取交集，获得的交集中药为初步筛选间接肝损伤风险中药。

2.3.2基于NF-κB通路富集的潜在间接肝损伤中药的关联强度值分析

运用TCMSP数据库（https：//www.tcmsp-e.com/）[16]、Pharm Mapper数据库（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）[17,18]检索中药成分及其结合靶点，当以上两个数据库检索无结果时，结合TCMIP数据库（http：//www.tcmip.cn）进行补充[19]，筛选2.3.1锁定的目标中药的成分及靶点，成分筛选条件为口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18，中药作用靶点筛选条件为拟合分数（fit score）≥3[17,18]。然后将筛选到的中药作用靶点及NF-κB通路上的靶点统一转换为蛋白质知识库（Uniprot KB）序列号，并将中药作用靶点富集到NF-κB通路，即得到能作用于NF-κB通路的中药，计算关联强度值，筛选该值中位数以上的中药。

2.3.3基于正调控NF-κB通路的潜在间接肝损伤中药的风险值分析

将2.3.2中富集到NF-κB通路的中药的靶点在DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov）中进行基因本体（GO）通路富集，筛选每味中药正调控NF-κB通路的靶点，然后分别计算每味中药的风险值，分析并筛选该风险值中位数以上的中药。

2.3.4潜在间接肝损伤风险中药指认及其正调控NF-κB通路靶点情况

同时满足大于关联强度值中位数且大于风险值中位数的中药，即为筛选出的具有潜在间接肝损伤风险中药。基于DAVID数据库分析该中药正调控NF-κB通路的靶点情况。

2.4间接肝损伤中药风险预测模式的验证

何首乌是传统“无毒”中药致肝损伤的热点药物[7,20,21]，本研究选择何首乌制剂进行预测模型的验证。参考补骨脂研究方法，筛选何首乌制剂中间接肝损伤风险中药，再进行基于NF-κB通路富集的潜在间接肝损伤中药的关联强度值分析，及基于正调控NF-κB通路的潜在间接肝损伤中药的风险值分析，最后按相应规则基于DAVID数据库分析该中药正调控NF-κB通路的靶点情况。

3、结果

3.1基于补骨脂制剂的间接肝损伤中药风险预测模式的构建

3.1.1补骨脂制剂中间接肝损伤风险中药的筛选

中药集1、中药集2和中药集3分别获得中药7味、115味和29味，三个中药集取交集，初步锁定补骨脂制剂中潜在间接肝损伤风险中药涉及淫羊藿、地黄、丹参和续断，见图1。

3.1.2基于NF-κB通路富集的潜在间接肝损伤中药的关联强度值分析

将淫羊藿、地黄、丹参、续断中符合筛选条件的成分靶点富集到NF-κB通路，计算其关联强度值分别为0.18、0.11、0.11和0.39，中位数为0.15，关联强度值>0.15的中药有淫羊藿和续断。

3.1.3基于正调控NF-κB通路的潜在间接肝损伤中药的风险值分析

将淫羊藿、地黄、丹参、续断四味中药富集到NF-κB通路的靶点在DAVID数据库中进行GO通路富集，筛选每味中药正调控NF-κB通路的靶点。计算得到正调控NF-κB通路的风险值分别为0.25、0.56、0.22和0.22，中位数为0.24，其中淫羊藿与地黄的风险值高于中位数。

3.1.4潜在间接肝损伤风险中药指认及该中药正调控NF-κB通路靶点情况

综合以上结果，仅有淫羊藿既满足关联强度值大于其中位数，又满足风险值大于其中位数。淫羊藿正调控NF-κB通路上的布鲁顿酪氨酸激酶（Btk）和蛋白激酶C theta(PKCθ)[22,23]，详见图2。

3.2间接肝损伤中药风险预测模式的验证

3.2.1何首乌制剂中间接肝损伤风险中药的初步筛选

中药集1、中药集2和中药集3分别获得中药27味、126味和52味，三个中药集取交集，初步锁定何首乌制剂中潜在间接肝损伤风险中药涉及21味中药：分别为羌活、地龙、菟丝子、白芍、甘草、当归、金樱子、红花、天麻、黑芝麻、地黄、豨莶草、枸杞子、赤芍、牛膝、墨旱莲、丹参、桑叶、女贞子、桑椹和补骨脂，见图3。

3.2.2基于NF-κB通路富集的潜在间接肝损伤中药关联强度值分析

以上21味中药中，地龙的成分及靶点相关数据库暂未收录，故纳入20味中药的靶点富集到NF-κB通路并进行分析，对应的关联强度值结果见表1，关联强度值的中位数为0.19。关联强度值>0.19的中药有菟丝子、金樱子、女贞子、桑椹、补骨脂、白芍、当归、羌活、赤芍和桑叶。

图1补骨脂制剂中间接肝损伤风险中药的筛选   

图2淫羊藿正调控NF-κB通路的靶点   下

图3何首乌制剂中间接肝损伤风险中药的筛选  

3.2.3基于正调控NF-κB通路的潜在间接肝损伤中药的风险值分析

以上20味中药的风险值结果见表1，风险值中位数为0.25。风险值>0.25的中药有地黄、墨旱莲、天麻、菟丝子、补骨脂、豨莶草、羌活、赤芍与红花。

3.2.4潜在间接肝损伤风险中药指认及该中药正调控NF-κB通路靶点情况

综合分析关联强度值与风险值二者中位数以上范围内的中药，得到菟丝子与补骨脂，其中菟丝子正调控NF-κB通路上的Btk和PKCθ[22,23]，补骨脂正调控该通路的TLR4、Ik B激酶β(IKKβ）、蛋白激酶Cβ(PKCβ）和TNF-α[24]，详见图4。

表1何首乌制剂中潜在间接肝损伤中药与NF-κB通路的关联强度值及风险值  

图4菟丝子、补骨脂正调控NF-κB通路的靶点   

4、讨论

药物间接毒性与生物活性物质及第三因素密切相关，如常与机体免疫及代谢通路叠加和过度活化有关，部分有剂量依赖关系，通常在正常动物模型上难以复制[11]。本研究基于间接毒性认知理论，构建了复方用药条件下中药间接毒性的肝损伤风险预测模式。

本研究发现淫羊藿或为补骨脂制剂中具有间接肝损伤作用的中药，提示补骨脂制剂中配伍淫羊藿可能增加其肝损伤。课题组前期进行靶向调控核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 (NLRP3）炎症小体的淫羊藿和补骨脂活性成分筛查，证实淫羊藿中有多个成分均可通过增强炎症小体活性诱发肝损伤，且配伍补骨脂较单独应用所致肝损伤更为严重[5]，佐证了本研究的预测准确性及方法的可行性。用已知有肝损伤的何首乌制剂验证该预测模式，筛选出间接肝损伤风险中药为补骨脂与菟丝子。《何首乌安全用药指南》[25]中指出，机体免疫紊乱或自身免疫性疾病患者应用何首乌可能增加肝损伤风险，阴虚火旺证、湿热内蕴证者建议慎用何首乌。在复方用药中，其他药物可能会通过增强机体免疫易感性或协同增强何首乌免疫活性从而增加肝损伤风险。菟丝子味辛、甘，性平，有补阳的功效。具有增强免疫的药理作用[26]。有研究[27]报道，菟丝子水提液可对大鼠造成毒性影响，还会影响孕鼠及其胚胎发育，提示菟丝子具有潜在毒性。补骨脂味辛、苦，性温，具有补肾壮阳、补脾健胃的功效，课题组前期基于LPS介导的免疫应激特异质肝损伤模型研究发现，补骨脂可通过调控磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂等代谢标志物的特异性改变，增强肝脏对LPS或其他炎症介质的反应性，促进TNF-α、血清白细胞介素1β(IL-1β）等炎症因子释放，诱导炎症小体激活引起免疫特异质肝损伤[5,28]，而何首乌在该模型上也能诱发肝损伤[21]。以上提示，补骨脂、菟丝子与何首乌配伍或能协同何首乌的肝毒性成分，从而增加肝损伤风险。在免疫过度活化类型疾病中医辨证属阴虚火旺或湿热内蕴者使用时更需要警惕其肝损伤风险，或在使用时加用养阴清热或清热利湿类中药[25]。此研究结果对临床合理用药具有一定的指导性作用。此外，通过NF-κB通路预测发现菟丝子正调控该通路的靶点与淫羊藿的一致，提示其可能与淫羊藿间接肝损伤具有相似的作用机制[11]。

该预测模式目前尚存在不足之处，有少数药物如地龙等成分不明确的中药在本研究所采用的数据库中缺少成分，暂不适用该模式预测其风险；此外，目前临床中关于中药毒性成分预测的数据较少，可能导致预测结果与临床实际存在偏差，从而影响成分靶点的可信度，因此有待进一步的外部数据验证加以优化，后续课题组将针对本预测模式筛选获得的潜在间接肝损伤药物进行动物实验验证。但本预测模式已尽可能缩小预测误差，所使用的TCMSP、Pharm Mapper、TCMIP数据库在一定限度上保证了信息全面、准确，来源可靠[16,17,18,19]，且课题组前期动物实验发现补骨脂制剂中配伍淫羊藿存在肝损伤风险的结论[5]可为本预测模式结果准确性提供参考。现实中采用实验筛选风险配伍药对工作量较大、且成本较高，而本预测模式缩小了实验的筛选范围，并降低研究成本，最终结果可作为风险提示，研究将有望为复方用药条件下中药间接肝损伤风险中药的预测提供可靠的技术支持和方法学参考。

参考文献:

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[2]肖小河."健康中国"战略下的中药安全性研究与思考[J].中国中药杂志,2018,43(5):857-860.

[3]肖小河,柏兆方,王伽伯,等.中药安全性评价与药物警戒[J].科学通报,2021,66(Z1):.407-414.

[4]唐进法,王晓艳,杨伟,等.基于统计建模的壮骨关节丸诱发特异质肝损伤相关易感性细胞因子分析[J].药学学报,2018,53(4).574-584.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2020.

[6]柏兆方,王伽伯,肖小河.中药毒性认知创新与安全精准用药[J].中国中药杂志,2022,47(10);2557-2564.

基金资助:国家自然科学基金(81721002,82204638);国家中医药管理局中医药创新团队及人才支持计划(ZYYCXTD-C-202005);

文章来源:母光頔,牛明,高云娟等.基于间接毒性认知的中药肝损伤风险预测模式的构建及应用[J].中医杂志,2023,64(17):1763-1770.