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肝细胞癌患者血清中FOXA2与FOXJ2的表达及临床意义

2023-09-06 96 上传者：管理员

摘要：目的:检测肝细胞癌(HCC)患者血清中叉头转录因子FOXA2与FOXJ2的表达水平，探讨FOXA2、FOXJ2与HCC患者肿瘤相关指标及无进展生存期的相关性。方法:选取河南中医药大学第一附属医院脾胃肝胆科2021年8月至2021年12月入院的HCC患者72人，收集患者血清。采用酶联免疫法检测HCC患者血清中FOXA2与FOXJ2的表达水平，分析其与HCC患者肿瘤相关指标及无进展生存期的相关性。计量数据与等级资料采用Spearman检验分析相关性；单因素相关性分析采用χ2检验；运用ROC曲线计算FOXA2和FOXJ2曲线下面积(AUC),根据约登指数最大法得到截断值；采用Kaplan-Merier法进行无进展生存期分析。结果:FOXA2与FOXJ2表达水平均与肝癌临床分期相关(P<0.05),经ROC诊断曲线分析发现，FOXA2与FOXJ2的AUC对诊断存在统计学差异(P<0.05),经生存曲线分析发现FOXA2、FOXJ2高表达组HCC患者的累积生存率均高于FOXA2、FOXJ2低表达组HCC患者(P<0.05)。FOXA2与FOXJ2在血清中的...更多。

关键词：
FOXA2
FOXJ2
肝癌
肝细胞癌
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原发性肝癌(primary hepatic carcinoma, PHC)在所有恶性肿瘤中的发病率居全国第4位，其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)约占75%～85%[1]。流行病学研究表明[2],中国每年死于肝癌的人数约占全球因肝癌死亡人数的50%,严重威胁我国居民健康，肝癌的预防、诊断及治疗是我国目前重点关注的公共卫生问题。肝癌患者早期症状不典型容易被忽视，发现时多合并不同程度肝硬化，肝功能较差，因此多中心复发率和肝内转移率都较高[3,4]。如何提高治疗效果、减少复发转移率、延长生存期、提高生活质量，成为HCC治疗的难题[5]。近年来，分子细胞生物学通过大量基础研究进一步阐明了HCC发生发展，侵袭和转移的相关机制，是当前社会关注的焦点，但目前临床常用的靶向药易产生耐药性，这促进了相关分子靶向药物的进一步研发[6]。

叉头盒蛋白(forkhead box, Fox)家族有49个基因，其中的大多数成员与癌症的发生发展有关[7,8]。叉头盒蛋白A2(forkhead box A2,FOXA2)与叉头盒蛋白J2(forkhead box J2,FOXJ2)可通过直接或间接作用抑制HCC发生发展、侵袭及转移，从而影响预后，是目前研究的热点。前期采用免疫组化SP法检测病理组织中FOXA2与FOXJ2的表达水平，并结合临床数据证实FOXA2与FOXJ2可影响HCC患者预后[9],本研究将通过检测HCC患者血清中FOXA2与FOXJ2的表达水平进一步验证两者抑制肝癌发生发展，为两者成为新的分子治疗靶点提供循证医学依据。

1、资料与方法

1.1病例来源

纳入河南中医药大学第一附属医院脾胃肝胆科2021年8月至2021年12月入院的HCC患者72人，病历资料均完整。本研究纳入所有患者均签署《知情同意书》,经河南中医药大学第一附属医院伦理委员会审核，伦理号：2021HL-136-02。

1.2病例标准

(1)诊断标准：HCC患者的诊断标准、肝功能Child-Pugh分级和巴塞罗那临床分期(Barcelona Clinic Liver Cancer, BCLC分期)均参照中国临床肿瘤学会指南工作委员会制定的《原发性肝癌诊疗指南》(2022年版)[1]。(2)纳入标准：①符合肝细胞癌诊断标准；②年龄：18～75岁，性别不限；③病历资料完整，自愿参加本实验并签署知情同意书。(3)排除标准：①既往或目前患有其它恶性肿瘤；②具有肝性脑病、难治性腹腔积液和严重感染发热患者；③孕妇或哺乳期病人及精神障碍疾病患者。(4)剔除病例标准：①不符合上述纳入标准而误纳者；②临床资料缺失的患者。

1.3实验方法

实验材料：酶标仪(Tecan)、37℃恒温箱(上海新苗)、FOXA2 ELISA试剂盒(江苏酶免)、FOXJ2 ELISA试剂盒(江苏酶免)。

实验步骤：提前4 h从-20℃冰箱取出待测血清样本，提前20 min从-4℃冰箱中取出样本试剂盒，以平衡至室温。根据试剂盒说明，分别设置空白孔、标准孔和样品孔。根据试剂盒说明书进行标准液配制，样品稀释度为5倍。加入配制好的样品和标准品，37℃恒温箱中反应30 min后弃去孔内液体。洗板5次，加入酶标试剂，37℃恒温箱中反应30 min后弃去孔内液体。洗板5次，依次加入显色剂A与显色剂B,37℃恒温箱中反应10 min后加入终止液。加入终止液15 min内使用酶标仪测定，以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。根据标准物的浓度，计算出样品的浓度，再乘以5倍的稀释倍数，即样品的实际浓度。

1.4统计学方法

本研究所有数据使用IBM SPSS 21.0软件和Excel进行数据处理及绘图。计数资料以例数或构成比表示，计量资料均首先进行正态性检验，符合正态分布的用均数±标准差表示，不符合正态分布使用非参数检验，用四分位数进行描述。计量数据与等级资料采用Spearman检验分析相关性，单因素相关性分析采用χ2检验。运用ROC曲线计算FOXA2和FOXJ2曲线下面积(area under curve, AUC),根据约登指数最大法得到截断值。采用Kaplan-Merier法进行无进展生存期分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1一般资料与FOXA2、FOXJ2的表达水平

共纳入HCC患者72例(表1),其中男性63例，女性9例，平均年龄为(60.2±11.3)岁；肝功能Child-Pugh分级中A级、B级和C级的患者分别占56.9%、31.9%和11.2%;肝癌分期中Ⅰ期-Ⅱ期的患者占比约56.9%,Ⅲ期-Ⅳ期占比约43.1%。FOXA2与FOXJ2表达为计量资料，经正态性检验FOXA2与FOXJ2表达不满足正态分布，采用四分位表达FOXA2与FOXJ2的具体水平；Speraman相关性分析发现FOXA2与FOXJ2在血清中的表达存在中等程度的正相关关系(rs=0.358,P=0.002)。

表1患者一般信息表

2.2 FOXA2与FOXJ2表达水平与预后的相关性

根据HCC患者肿瘤复发及进展情况，利用ROC诊断曲线来推断FOXA2与FOXJ2表达对肝癌患者进展的诊断价值，满足AUC(ROC曲线下面积)>0.6及P<0.05认为该指标对诊断存在统计学差异，以此来判断最佳临界值。ROC诊断曲线分析发现，FOXA2的AUC为0.778(95%CI:0.669,0.887),P=0.000,对诊断存在统计学差异，根据约登指数最大法得到最佳临界值64.9,详见图1。FOXJ2的AUC为0.672(95%CI:0.546,0.799),P=0.012,对诊断存在统计学差异，根据约登指数最大法得到最佳临界值47.7,详见图1。

根据ROC诊断曲线得出的FOXA2与FOXJ2的最佳临界值，将FOXA2与FOXJ2分为高表达组与低表达组。对收集的72例HCC患者6个月的无进展生存时间及生存情况进行Kaplan-Meier生存曲线分析，结果显示：FOXA2、FOXJ2高表达组HCC患者的累积生存率均高于FOXA2、FOXJ2低表达组HCC患者(P=0.006,P=0.01),详见图2。

图1 FOXA2与FOXJ2的ROC诊断曲线

图2 FOXA2与FOXJ2高低表达组HCC患者的生存曲线

2.3 FOXA2与FOXJ2表达水平与临床病理特征的相关性

根据ROC诊断曲线得出的FOXA2与FOXJ2的最佳临界值，将FOXA2与FOXJ2分为高表达组与低表达组，并与肝癌临床病理特征进行单因素相关性分析发现FOXA2表达水平与肿瘤直径、有无门脉癌栓、有无转移、肝癌分期相关(P<0.05),与性别、年龄、肿瘤个数无关(P>0.05);FOXJ2表达水平与肿瘤直径、有无门脉癌栓、肿瘤个数、肝癌分期相关(P<0.05),与性别、年龄、有无转移无关(P>0.05),见表2。

3、讨论

肝细胞癌因其复发率高、预后差而成为我国重点关注的公共卫生问题，尽管目前分子靶向药与免疫检查点抑制剂的问世已使部分患者的生存状况得到改善，但HCC的根治性治疗仍然具有挑战性[10,11,12]。近年来随着分子细胞生物学的发展初步阐明了癌症从生长到侵袭和转移的复杂机制，同时也促进了相关分子靶向药物的研发[13]。而FOX家族基因也被证明可作为癌基因或肿瘤抑制基因参与癌症的发生及发展[14,15],以FOX家族为基石的基因治疗可能成为肝癌治疗的又一新方向[16]。

表2 FOXA2、FOXJ2的表达水平与HCC患者临床病理特征的关系

FOXA2与FOXJ2是叉头类DNA结合蛋白的成员，是肝脏器官发生和体内平衡过程中必不可少的转录因子[17]。转录调控是基因调控诸多方式中最常见的方式之一，转录因子通过结合特定的DNA序列来控制从DNA到信使RNA的遗传信息转录速率，转录包括引发和调节基因转录的蛋白质等多种因素[18,19],而肝组织含有的FOX转录因子的失调或突变与肝癌的发生发展关系密切[20]。近年来，有多篇文献报道FOXA2在黑色素瘤、食管鳞状细胞癌、肝内胆管癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等肿瘤细胞中的高表达可抑制肿瘤增殖、侵袭及转移[21,22,23,24,25]。同样，FOXA2与HCC的发生发展关系密切。研究发现在HCC的异种移植动物模型中，FOXA2过表达可显著抑制肿瘤生长，同时过表达的FOXA2可通过上调雷帕霉素途径的单磷酸腺苷激活蛋白激酶机制靶标来增强仑伐替尼对HCC细胞的抑制作用[26];FOXA2可提高HCC细胞的糖基化水平，导致HCC细胞生存信号通路的激活[27];长链非编码RNA00261的转录可促进FOXA2的表达从而抑制肝癌细胞中的上皮-间充质转化，进而抑制HCC细胞迁移、侵袭和肺转移病变的形成[28]。研究前期通过免疫组化SP法发现，FOXA2的表达水平与HCC的发生发展及预后相关，FOXA2的高表达可延缓患者总生存周期[9]。这些结果表明FOXA2在HCC中起着抑癌作用，FOXA2在肝癌细胞中的高表达抑制了肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移的能力。本研究通过酶联免疫法发现FOXA2表达水平与肿瘤直径、有无门脉癌栓、有无转移、肝癌分期相关(P<0.05),FOXA2阳性表达组HCC患者的累积生存率高于FOXA2阴性表达组HCC患者，提示FOXA2的表达水平与HCC的发展及预后相关，FOXA2在HCC的发展过程中发挥了重要作用，提示FOXA2可能为影响预后的重要基因。

FOXJ2在抑制肿瘤发生发展中也扮演着重要角色，研究证明FOXJ2可抑制结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤细胞的侵袭和转移，其表达水平在肿瘤组织中下调，且表达水平降低与肿瘤患者预后不良呈正相关[29,30,31]。在HCC中，ZHANG等[32]通过染色质免疫沉淀分析发现FOXJ2通过直接结合其启动子来调节E-钙黏蛋白的转录，来抑制HCC发育过程中的细胞迁移和侵袭，表明FOXJ2同样通过上皮间质转化影响HCC发生发展；有研究发现FOXJ2的蛋白表达水平在110例HCC患者的组织中显著下调，而高表达的FOXJ2可显著提高患者生存率，同时在小干扰RNA干扰FOXJ2的表达后可导致HepG2细胞增殖的促进[33]。这些均与本研究的结果一致。本研究通过酶联免疫法与临床数据相结合证实FOXJ2的表达水平与肿瘤直径、有无门脉癌栓、肿瘤个数、肝癌分期相关(P<0.05);FOXJ2高表达组HCC患者的累计生存率显著低于FOXJ2低表达组患者(P<0.05)。由此可见，FOXJ2在HCC中发挥抑癌基因的作用，FOXJ2的表达水平与HCC的发生发展及预后关系密切，表明FOXJ2可能为影响肝细胞癌患者预后的重要因素。

FOXA2、FOXJ2通过发挥抑癌作用参与癌症的发生及发展，本研究通过基础实验与临床数据相结合，分析FOXA2、FOXJ2表达水平与HCC患者肝功能及预后的关系，表明FOXA2、FOXJ2可能为影响肝细胞癌患者的肝功能及预后的重要因素，结合前期研究基础，为肝癌诊断与治疗提供了新的循证医学证据。同时本研究表明，FOXA2和FOXJ2在HCC患者血清中的表达水平仍呈显著正相关，表明协同影响HCC的发生发展，未来有望共同应用于临床上癌症的诊断、治疗及预后评估。

参考文献:

[1]国家卫生健康委办公厅原发性肝威诊疗指南(212年反[!J]临6东开框房杂志,2123802)128-10.

[2]甲小问,陈欣论莞,赵云霞,等又头转录因子A.､J2在犴细胞信组织中的表达及意义(J.豹6家肝遗病杂志,20213706)1842-347.

基金资助:国家科技重大专项(民口)课题(编号:2018ZX10303-502);河南省科技厅河南省重点研发与推广专项(编号:232102310188);河南省特色骨干学科中医药第二批学科建设项目(编号:STG-ZYX03-202126);

文章来源:张鑫,冉小柯,陈茜等.肝细胞癌患者血清中FOXA2与FOXJ2的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学,2023,31(20):3817-3821.