肝癌的防治是一项重大的公共卫生挑战。柴胡皂苷(saikosaponins, SSs)是传统中药柴胡的主要生物活性成分，根据其结构差异将柴胡皂苷分为柴胡皂苷a、b (b1-b4)、c、d、e、f、g、h和i[1]。研究发现，SSb2通过以环境依赖性方式抑制多药耐药相关的药物转运蛋白P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRPs) MRP1和 MRP2来增强抗癌的肝靶向性[2]。本课题组前期研究发现，SSb2可以通过下调核因子-κB蛋白表达以及上调沉默信息调节因子6(silent information regulator 6,SIRT6)蛋白表达对脂多糖/氨基半乳糖(galactosamine, GalN)诱导的小鼠急性肝损伤起到保护作用[3]。此外，在体内实验中还发现SSb2可以通过调控SIRT6介导的糖代谢通路减轻二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)诱导的小鼠原发性肝癌[4]。本研究旨在从体外实验深入探讨SSb2对肝癌细胞的作用以及其抗肝癌作用是否是通过SIRT6介导。

一、材料与方法

1 材料

细胞株

肝癌Bel-7402、HepG-2、Huh-7细胞株，均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

药品与试剂

SSb2,纯度：>99%,批号：MUST-19032104,成都曼思特生物科技有限公司生产。噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT],德国Biofrox公司生产；腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)含量测试盒、葡萄糖测试盒、乳酸(lactic acid, LD)测试盒，均购自南京建成生物工程研究所；兔多抗SIRT6抗体、兔多抗丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1(pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1, PDK1)抗体，均购自武汉三鹰生物技术有限公司；兔多抗缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF1α)抗体、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A, LDHA)抗体、小鼠单抗β-actin、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗，均购自武汉博士德生物工程有限公司；兔单抗葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1, GLUT1)抗体，美国Affinity公司生产；Lipofectamine 2000转染试剂盒，美国Invitrogen公司生产。

仪器

GZX-DH-40×45型倒置显微镜，德国Leica公司产品；Multiskan FC型酶标仪，美国ThermoFisher公司产品；QuantStudio 6型实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)仪，美国ABI公司产品。

2 实验方法

2.1 用MTT法检测Huh-7、HepG2、Bel-7402细胞存活率

取对数生长期的Huh-7、HepG2、Bel-7402细胞，培养24h后，给药组分别加入0、25、50、100、200和400 mg·L-1的SSb2,对照组给予等量培养液。孵育20 h后，每孔加入MTT 10 μL继续培养4 h, 弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL,避光震荡10 min, 酶标仪检测光密度值(optical density, OD)。计算细胞存活率：细胞存活率(%)=药物组OD/细胞对照组OD×100%。

2.2 细胞转染

取对数生长期且生长状态良好的HepG2细胞，用MEM培养液制成单细胞混悬液，按每孔2×105个的细胞量均匀的接种到6孔板中，37 ℃,培养过夜；提前2 h, 将培养基换成无血清的MEM培养基；将实验分为5组：空白组、阴性对照组、si-SIRT6-472组、si-SIRT6-827组、si-SIRT6-1407组，按照试剂盒说明进行瞬时转染，6 h后弃去转染液，更换为细胞培养液。

2.3 细胞分组与处理方法

根据定量PCR和蛋白质印迹(Western blot)法检测的SIRT6的表达水平，挑选转染效率较高的一组进行后续实验，将实验分为空白对照组(nagetive control, NC)、SSb2组、si-SIRT6组、si-SIRT6+SSb2组，NC组与SSb2组分别加入含阴性质粒的转染溶液，si-SIRT6组和si-SIRT6+SSb2组加入含si-SIRT6质粒的转染溶液，按照“2.2”项细胞转染方法进行瞬时转染。转染24 h后，SSb2组与si-SIRT6+SSb2组加入SSb2,质量浓度为80 mg·L-1,各组继续转染24 h后收集细胞用于后续实验。

2.4 用定量PCR法检测SIRT6 mRNA的表达

收集转染后的细胞，加入Trizol试剂提取细胞总RNA,按照反转录试剂盒操作，逆转录条件：25 ℃,5 min, 50 ℃,15 min, 85 ℃,5 min, 4 ℃保存。通过PCR扩增，PCR反应条件：95 ℃预变性10 min, 95 ℃变性15 s, 60 ℃退火延伸60 s, 40个循环。检测各样本中SIRT6的mRNA水平，以GAPDH为内参，相对表达水平用2-ΔΔCt表示，△Ct=(Ct目的基因-CtGAPDH)。

2.5 HepG2细胞内ATP含量、葡萄糖含量和乳酸含量测定

按照以上分组制备细胞悬浮液待用。取出制备好的各组细胞悬浮液进行离心，以1 000 r·min-1,离心10 min(离心半径为10 cm, 下同),弃上清液，留细胞沉淀；用磷酸盐缓冲液清洗1～2次，以1 000 r·min-1离心10 min, 留下层细胞沉淀；加入磷酸盐缓冲液0.2～0.3 mL进行匀浆，并在100 ℃水浴条件下超声波破碎。将破碎的细胞煮沸10 min后混匀，用试剂盒测试HepG2细胞内ATP含量；另取以上制备好的各组细胞悬浮液置于离心管内，以2 000 r·min-1,5 min, 取上清液作为待测样本，分别用试剂盒测试上清液中葡萄糖含量和乳酸含量。

2.6 蛋白质印迹法检测HepG2细胞中糖代谢通路相关蛋白的表达

将“2.4”收集的转染后的各组细胞分别接种至6孔板中，分组同“2.5”。弃去培养液，PBS润洗3次；加入RIPA裂解液提取蛋白，BCA试剂法测定蛋白浓度。经SDS-聚丙烯凝胶电泳后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h, 分别加入配好的一抗溶液，4 ℃冰箱孵育过夜。TBST充分洗涤PVDF膜3次，加入HRP标记二抗37 ℃摇床孵育2 h。用ECL化学发光法显色，显影液发光显色，晾干胶片。用Gel-Pro analyzer 4.0 分析软件对条带进行分析，目的蛋白的相对表达水平以目的蛋白与内参蛋白光密度值的比来表示。

3 统计学处理

用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料用x¯±s表示，比较用单因素方差分析，组间两两比较用Tukey’s test。

二、结果

1 SSb2对肝癌细胞存活率的影响

随着浓度的增加和时间的延长，Huh-7、HepG2、Bel-7402肝癌细胞的存活率逐渐降低，说明SSb2能够显著抑制肝癌细胞的增殖，且其作用有时间和剂量依赖性；HepG2、Bel-7402 、Huh-7肝癌细胞在24 h的IC50分别为(94.38±2.54)、(124.48±0.46)和(224.66±20.41)mg·L-1,在48 h的IC50分别为(57.84±0.07)、(86.13±8.88)和(124.01±8.40)mg·L-1。上述结果显示，以上肝癌细胞中HepG2细胞对SSb2作用最敏感。因此，最终选用80 mg·L-1的SSb2以及HepG2细胞用于后续实验，选择24 h作为后续研究中SSb2的作用时间。

2 细胞转染沉默SIRT6后HepG2细胞内SIRT6 mRNA和蛋白的表达变化

细胞分为空白对照组(NC)、SSb2组、沉默信息调节因子6(SIRT6)si-RNA组(si-SIRT6)、si-SIRT6+SSb2组，NC组与SSb2组分别加入含阴性质粒的转染溶液，si-SIRT6组和si-SIRT6+SSb2组加入含si-SIRT6质粒的转染溶液，先转染24 h后，SSb2组和si-SIRT6+SSb2组加入80 mg·L-1的SSb2,各组继续转染24 h细胞转染沉默SIRT6。

空白组、NC组、si-SIRT6-472、si-SIRT6-827和si-SIRT6-1407组细胞内SIRT6 mRNA相对表达水平分别为1.07±0.06、0.93±0.15、0.35±0.03、0.65±0.07和0.76±0.12,si-SIRT6-472、si-SIRT6-827和si-SIRT6-1407组与空白组相比，上述指标均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);si-SIRT6-472、si-SIRT6-827组与NC组相比上述指标均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);Western blot结果如图1所示，空白组、NC组、si-SIRT6-472、si-SIRT6-827和si-SIRT6-1407组细胞内SIRT6 蛋白相对表达水平分别为0.45±0.02、0.34±0.03、0.13±0.02、0.30±0.02和0.33±0.02,si-SIRT6-472、si-SIRT6-827、si-SIRT6-1407组与空白组比较，SIRT6蛋白相对表达水平均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.01);而si-SIRT6-472、si-SIRT6-827、si-SIRT6-1407组与NC组相比，仅si-SIRT6-472组差异有统计学意义(P<0.01),因此最终选择干扰效率较高的si-SIRT6-472进行后续实验。

图1 细胞转染沉默沉默信息调节因子6(SIRT6)后HepG2细胞内SIRT6蛋白的表达变化

3 SSb2对HepG2细胞中ATP、葡萄糖摄取以及乳酸生成量的影响

SSb2组ATP、葡萄糖摄取以及乳酸生成量与NC组相比，差异有统计学意义(P<0.01);si-SIRT6组ATP、葡萄糖摄取以及乳酸生成量与NC组相比，差异有统计学意义(P<0.01);si-SIRT6+SSb2组ATP、葡萄糖摄取以及乳酸生成量与SSb2组相比，差异有统计学意义(P<0.01),提示SIRT6沉默后SSb2抑制糖酵解能力减弱，见表1。

表1 柴胡皂苷b2(SSb2)对HepG2细胞中腺苷三磷酸(ATP)、葡萄糖摄取量和乳酸生成量的影响(x¯±s,n=9)

图2 SSb2对HepG2细胞中糖代谢通路相关蛋白表达的影响(x¯±s,n=3)

4 SSb2对HepG2细胞内糖代谢通路相关蛋白表达的影响

NC组、SSb2组、si-SIRT6组和si-SIRT6+SSb2组SIRT6蛋白的相对表达水平分别为0.29±0.06、0.70±0.06、0.06±0.03和0.17±0.04,HIF1α蛋白的相对表达水平分别为0.18±0.03、0.06±0.03、0.44±0.04和0.22±0.04,GLUT1蛋白的相对表达水平分别为0.63±0.05、0.30±0.09、1.34±0.12和0.51±0.09,PDK1蛋白的相对表达水平分别为0.53±0.12、0.22±0.08、1.60±0.14和0.86±0.15,LDHA蛋白的相对表达水平分别为0.27±0.03、0.08±0.02、0.36±0.05和0.13±0.02。SSb2组与NC组比较，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);si-SIRT6组与NC组比较，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);si-SIRT6+SSb2组与SSb2组比较，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。

三、讨论

与正常细胞不同，肿瘤细胞会选择特定的代谢途径来满足其快速增殖的需求。葡萄糖代谢异常是肿瘤代谢重编程的主要方式之一[5]。研究表明，即使在氧气充足的情况下，癌细胞也表现出高水平的糖酵解[6]。本研究结果显示，SSb2可以降低HepG2细胞内ATP以及细胞上清液中乳酸以及葡萄糖的含量，说明SSb2可能是通过抑制HepG2细胞的有氧糖酵解从而发挥抑制肝细胞癌增殖的作用。

HIF1α是肿瘤有氧糖酵解的关键转录因子之一，通过激活糖酵解相关基因的转录，在肿瘤有氧糖酵解过程中发挥主要作用[7]。一系列研究证明，HIF1α的激活是多种癌症的共同特征[8]。HIF1α作为多个基因的直接转录激活因子，一方面，其通过上调糖酵解关键基因的表达来增强糖酵解通量[9],另一方面，HIF1α通过上调PDK基因的表达直接抑制线粒体呼吸[10]。PDK反过来使丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)磷酸化和失活，而PDH是一种限速酶，其将丙酮酸转化为乙酰辅酶a, 为三羧酸循环提供燃料。

SIRT6是一个高度保守的NAD+依赖性去乙酰化酶家族成员，近年来发现其在人类的寿命与衰老、肿瘤、糖脂代谢、炎症反应和能量代谢等方面发挥着重要的调控作用[11]。SIRT6在人类多种癌症中的表达下调与肿瘤进展密切相关。研究发现，SIRT6主要是通过调节肿瘤能量代谢、杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤相关信号转导、增加肿瘤治疗的敏感性等发挥抑瘤因子的作用[12]。研究发现，SIRT6可以抑制HIF1α的表达来抑制肿瘤的发生和发展[13]。在糖酵解过程中，SIRT6是转录激活因子HIF1α的一个竞争性因子，而HIF1α可以调节多种基因来激活糖酵解，同时抑制线粒体呼吸作用[14]。

本课题组前期在体内实验发现，SSb2可能是通过上调SIRT6基因的表达，从而抑制HIF1α调控的糖酵解通路，最终实现对肝癌的抑制作用[4]。本研究结果显示，SSb2可以上调SIRT6蛋白的表达，降低HIF1α以及糖酵解通路相关蛋白GLUT1、LDHA、PDK1的表达，该结果与体内实验结果一致。SIRT6沉默后，HepG2细胞的糖酵解能力增强，细胞内糖酵解代谢产物ATP含量增加，葡萄糖摄取增加，同时乳酸生成也增加。SIRT6沉默后再次给予SSb2,HepG2细胞的ATP生成量、葡萄糖摄取以及乳酸生成均降低，说明SSb2抑制肝癌细胞的糖酵解能力可能是通过调控SIRT6的表达而实现的。Western blot的结果也显示了SIRT6沉默后，SSb2对HIF1α以及糖酵解相关因子GLUT1、PDK1和LDHA的下调作用明显减弱，进一步说明了SSb2调控糖酵解通路相关蛋白的表达可能是通过SIRT6介导的。

参考文献:

[3]有曼,李瑞芳,高子涵,等.柴胡皂苷b2对LPS/GalN诱导的小鼠急性肝损伤炎症和能量代谢的影响[J].中国中药,2019,44(14):2966-2971.

[4]有曼,张虹,何广宏,等.柴胡皂苷b2通过调控沉默信息调节因子6介导的糖代谢通路减轻二乙基亚硝胺诱导的小鼠原发性肝癌[J].中国药理学与毒理学杂志,2022,36(10):739-745.

[8]周筠,洪莉,黄金玲,等.YC-1增强顺铂对卵巢癌A2780s细胞的增殖抑制和促凋亡作用[J].中国临床药理学杂志,2019,35(2):137-139.

[12]马澜婧,马玉帛,张松,等.SIRT6与肿瘤关系的研究进展[J].临床肿瘤学杂志,2015,20(8):745-749.

[13]何延浩,王维蓉,林蓉.SIRT6与心血管､肿瘤及代谢性疾病[J].生理科学进展,2016,47(4):271-275.

基金资助:河南省科技攻关重点基金资助项目(202102310486);

文章来源:有曼,陈洁,何广宏等.柴胡皂苷b2对肝癌细胞增殖的影响及机制[J].中国临床药理学杂志,2023,39(22):3281-3285.