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USP11调控VEGF表达及血管形成促进肝癌细胞的侵袭和转移

2024-02-21 129 上传者：管理员

摘要：目的:探究去泛素化酶11(USP11)调控VEGF和血管形成促进肝癌细胞侵袭和转移能力的机制。方法:运用Real-time PCR实验检测USP11对肝癌细胞中VEGF基因表达水平的影响；应用Elisa实验检测USP11对肝癌细胞分泌VEGF蛋白的影响；利用对照组和USP11敲低组肝癌细胞分泌上清分别处理血管内皮细胞HUVECs,运用Transwell基质胶实验检测血管内皮细胞的迁移能力；运用CCK-8实验检测血管内皮细胞的增殖能力；运用小管形成实验检测血管内皮细胞的成管能力。结果:敲低USP11可降低肝癌细胞中VEGF的基因表达水平(P<0.01),并抑制肝癌细胞分泌VEGF蛋白(P<0.001);与对照组相比，敲低USP11的肝癌细胞分泌上清处理血管内皮细胞，血管内皮细胞的增殖能力减弱(P<0.01),成管能力也远低于对照组；两组肝癌细胞和血管内皮细胞共培养，基质胶实验表明，敲低USP11组，血管内皮细胞的迁移能力降低(P<0.01)。结论:USP11可以增加VEGF的基因转录和蛋白表达水平，增强血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力，进而促进肝癌细胞的侵袭和转移。

关键词：
USP11
VEGF
侵袭转移
肝癌
血管形成
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肝癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，其恶性度高、预后差，已经得到了世界上的公认[1]。肝癌术后转移和复发是患者治疗失败和死亡的主要原因[2]。探究肝癌转移的分子机制，对肝癌的临床治疗至关重要。去泛素化酶11(deubiquitination enzyme 11,USP11)的异常表达与多种肿瘤的不良预后密切相关，USP11高表达的病人其复发和死亡的风险都远高于正常人[3,4,5]。我们前期研究结果也发现：USP11通过调控NF90蛋白泛素化程度促进肝癌细胞的增殖能力，USP11在肝癌组织和细胞中异常高表达，体内、外实验也证实了USP11可增强肝癌细胞的侵袭和转移能力。目前，关于USP11调控肝癌细胞侵袭和转移能力的具体分子机制，报道较少。本文通过慢病毒介导的干扰技术沉默肝癌细胞MHCC-97h和SMMC-7721中USP11的表达，探讨其调控肝癌细胞侵袭与转移的分子机制，补充USP11在肝癌恶性进展中发挥的重要作用，以期为肝癌临床治疗提供新的潜在靶点。

1、材料与方法

1.1 材料与试剂

人肝癌细胞株MHCC-97h和SMMC-7721购于上海细胞生物研究所，RPMI-1640和DMEM培养基均购自Gibco公司，胎牛血清购于Serana公司，质粒小提中量试剂盒购于Tiengen公司，逆转录试剂盒购于Promega公司，PCR试剂盒购于Takara公司，CCK-8试剂盒购于Dojindo公司，Transwell小室购于BD公司，抗USP11抗体购于Proteintech公司。

1.2 稳转细胞系的构建

PCR引物退火形成双链产物，酶切重组表达载体，1% DNA琼脂糖凝胶电泳，参照胶回收试剂盒说明书回收相应DNA片段。将酶切回收后载体与相应的PCR产物连接。取10 μL连接产物加入到感受态大肠杆菌DHα中轻轻混匀，冰上放置40 min, 42 ℃水浴热激90 s, 立即置于冰上15 min, 加入600 μL LB培养基，预摇1 h, 将混合液涂入培养皿。倒置于37 ℃培养箱中孵育过夜，然后行单个菌落挑点测序，根据结果挑取正确序列菌液摇菌扩增，依据高纯度质粒小提中量试剂盒操作说明书提取目的质粒。按以下体系包装慢病毒：基础培养基300 μL、目的质粒2 μg、包装质粒PH1 1.5 μg包装质粒PH2 0.5 μg、转染试剂Turbofect 8 μL。将上述体系充分混匀后静置20 min, 缓慢滴入含293细胞的六孔板中。在细胞培养箱中培养24 h后，去除上清，加入3 mL含胎牛血清培养基培养。24 h后收集病毒上清，3 000 r/min, 10 min离心，将病毒上清1 mL与Polybrene 2 μL混匀后加入含约50%目的细胞的六孔板中。12 h后更换培养基，并于24 h后用嘌呤霉素筛选出稳转细胞株。提取相应的RNA验证效果。

1.3 Real-time PCR实验

Trizol法提取各样本的总RNA,测定RNA的浓度。采用逆转录试剂盒合成cDNA,以cDNA为模板进行Real-time PCR扩增。反应体系为：SYBR Grene 10 μL,去核酸水8 μL,引物1 μL,cDNA 1 μL。反应条件为：95 ℃预变性60 s, 95 ℃变性15 s, 60 ℃退火15 s, 72 ℃延伸45 s, 共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。引物分别为：VEGF 上游5′-CACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3′,下游5′-CACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3′;USP11上游5′-CGTTTCCGGGACCAGAATCC-3′,下游5′-CATCGCCGTCCGTTCTCTTC-3′。

1.4 Elisa实验

参照Elisa试剂盒说明书的方法，分别设标准品孔、空白孔和待测样品孔。待测样品孔先加样品稀释液40 μL,再加待测样品10 μL,37 ℃温育30 min, 加入酶标试剂50 μL后显色，以空白孔调零，450 nm波长测定各孔的吸光度，计算上清中VEGF的表达水平。

1.5 Transwell基质胶实验

Transwell小室上层加入基质胶，置于培养箱中进行固化。在Transwell下层培养孔加入500 μL的含有不同肝癌细胞分泌上清的培养基，上层小室加入100 μL稀释的血管内皮细胞，培养箱培养24 h, 用棉签拭去上层小室未迁移的细胞，4%甲醛固定，结晶紫染色，倒置显微镜观察迁移细胞并计数。

1.6 CCK-8实验

取对数生长期的肝癌细胞，调整细胞浓度，向96孔板中每孔加入约2 000个细胞，培养箱孵育。需要测量时，取出孔板，去除培养基，加入CCK-8混合液，37 ℃孵育1 h。使用分光光度计在450 nm的波长处测量吸光度，绘制增殖曲线。

1.7 小管形成实验

基质胶4 ℃溶解后铺于96孔板，置于细胞培养箱中孵育1 h以固化基质胶。血管内皮细胞HUVECs稀释浓度至2×105个/mL后，加入150 μL体积至96孔板中，分别用对照组和USP11敲低组肝癌细胞分泌上清进行处理，孵育18 h, 倒置显微镜观察，每组随机选取5个不同的视野进行统计分析。

1.8 统计学分析

所有数据采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以均值±标准差表示，不同组间结果比较用单因素方差分析，两两比较则采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 敲低USP11抑制肝癌细胞中VEGF的基因表达水平

首先在肝癌细胞MHCC-97h和SMMC-7721中构建USP11敲低的稳转细胞株，Real-time PCR验证其敲低效果，与空白对照组相比，敲低组肝癌细胞中USP11基因表达水平明显下调(P<0.001,图1)。接着，Real-time PCR检测两组肝癌细胞中VEGF基因表达情况，结果发现，USP11敲低后，肝癌细胞中VEGF的基因表达水平明显减少(P<0.01,图1)。

2.2 敲低USP11抑制肝癌细胞VEGF蛋白的分泌水平

收集两组肝癌细胞上清，采用Elisa实验检测上清中VEGF蛋白的分泌水平。结果表明，USP11敲低后，肝癌细胞分泌VEGF蛋白的量明显减少(P<0.001,图2)。

2.3 敲低USP11抑制血管内皮细胞的增殖能力

空白对照组和USP11敲低组肝癌细胞分泌上清，分别处理血管内皮细胞HUVECs, CCK-8实验检测内皮细胞的增殖能力。结果表明，USP11敲低组，血管内皮细胞的增殖能力被削弱(P<0.01,图3)。

图1 敲低USP11抑制肝癌细胞中VEGF的基因表达水平

图2 敲低USP11抑制肝癌细胞VEGF蛋白的分泌水平

2.4 敲低USP11抑制血管内皮细胞的成管能力

采用不同的肝癌细胞分泌上清处理血管内皮细胞，小管形成实验表明，USP11正向调控血管内皮细胞的成管能力(图4)。

2.5 敲低USP11抑制血管内皮细胞的迁移能力

两组肝癌细胞分别和血管内皮细胞共培养，基质胶实验表明，敲低USP11组，血管内皮细胞的迁移能力降低(P<0.01,图5)。

3、讨论

肝癌是人类常见的消化道恶性肿瘤，全球每年新发肝癌病例中50%发生于中国，我国的肝癌诊治形势十分严峻，患者手术后的转移和复发是肝癌患者治疗失败和死亡的主要原因[2]。因此，深入探究肝癌复发和转移的分子机制，具有重要的临床意义。

图3 敲低USP11抑制血管内皮细胞的增殖能力

泛素-蛋白酶体途径是细胞内蛋白质降解的主要途径之一。去泛素化酶通过水解作用破坏多聚泛素化链之间或泛素与其底物之间的硫酯键，移除泛素分子，从而保护靶蛋白不被蛋白酶体所水解。其成员之一去泛素化酶USP11的异常表达与多种肿瘤的不良预后密切相关[3,4,5]。既往研究已经证实，USP11可促进乳腺癌[3]、非小细胞肺癌[6]以及黑色素瘤[7]细胞的增殖能力和结直肠癌细胞[8]的侵袭转移能力。USP11还促进卵巢癌细胞的上皮间质转化[9]。另外，USP11可调控胃癌、卵巢癌和直肠癌患者对临床化疗药物的敏感程度[10,11,12]。然而，USP11在肝癌中的表达及其调控肝癌细胞生物学行为的作用报道较少。QIAO等[13]研究发现E2F1/USP11轴通过激活ERK/mTOR信号通路促进肝癌细胞的侵袭和抑制自噬能力。我们前期研究数据也表明，USP11通过抑制NF90蛋白的泛素化程度，稳定其表达水平，进而促进肝癌细胞的增殖能力[14]。另外，USP11异常高表达与肝癌患者的不良预后相关，体内、体外实验均证实了USP11可以增强肝癌细胞的侵袭和转移能力[15]。总之，USP11对肿瘤的发生机制、诊断以及治疗有着巨大的研究价值。

为了进一步探究USP11调控肝癌细胞侵袭和转移能力的分子机制，本研究采用慢病毒质粒介导的方法，在MHCC-97h和SMMC-7721两株肝癌细胞系中构建了USP11敲低的稳转细胞株，通过RNA-seq和GO/Pathway功能分析了USP11所调控的下游并与细胞侵袭转移密切相关的靶基因，结果发现VEGF、MMP28、ECM1 等差异性表达的基因。我们选择VEGF基因作为本研究的靶点，基于大量研究数据已经证实VEGF与肝癌细胞的侵袭能力相关[16,17,18]。首先，Real-time PCR实验检测两组肝癌细胞中VEGF基因的表达水平，结果表明USP11可上调肝癌细胞中VEGF的基因转录水平，Real-time PCR实验结果与基因芯片检测结果相一致。Elisa实验也证实，USP11可增强肝癌细胞分泌VEGF蛋白的能力。由此可见，USP11可促进肝癌细胞中VEGF基因转录水平，并促进肝癌细胞分泌VEGF蛋白。

图4 敲低USP11抑制血管内皮细胞的成管能力(×200)

图5 敲低USP11抑制血管内皮细胞的迁移能力(结晶紫染色×200)

既然USP11与VEGF之间存在正向调节的关系，但USP11作为细胞内的去泛素化酶，通过与多种底物相互结合，介导底物泛素化水平和蛋白稳定性，进而发挥多种生物学功能[19,20,21]。USP11主要定位于肝癌细胞核[15],然而，生物信息学软件分析没有提示到USP11可能结合到VEGF的基因启动子区域，因此两者是间接或直接调控关系尚不明确，仍需要进一步探讨。

研究表明，VEGF促进肿瘤血管和淋巴管的生成[22,23]。上述实验结果表明，USP11正向调控肝癌细胞中VEGF的基因和蛋白表达水平，我们猜测USP11是否调控肿瘤血管生成，进而促进肝癌的侵袭和转移。我们将肝癌和血管内皮细胞HUVECs共培养，采用对照组和USP11敲低组肝癌细胞分泌上清分别处理血管内皮细胞，实验数据表明，USP11增强血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力。

综上所述，本研究证实了USP11上调肝癌细胞中VEGF的转录和蛋白分泌，进而增强血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力，最终促进肝癌细胞的侵袭和转移。但本研究还存在一定的局限性，我们仅做了体外细胞实验层面的初步探索，在下一步的研究中通过收集更多的临床样本以及动物实验来验证我们的实验结果，进一步明确USP11/VEGF调控血管形成进而促进肝癌的侵袭和转移。本研究结果是USP11调控肝癌细胞侵袭和转移能力分子机制的一个重要补充，为USP11有望成为临床肝癌靶向治疗新靶标提供重要的参考依据和实验基础。

参考文献:

[22]朱苹,黄月盈,康桂钰,等.肺腺癌中α5-nAChR和VEGF的表达相关性及其对血管形成的影响[J].临床与实验病理学杂志,2021,37(12):1450-1455.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(编号:81871910);

文章来源:杜宝英,张盛.USP11调控VEGF表达及血管形成促进肝癌细胞的侵袭和转移[J].现代肿瘤医学,2024,32(06):983-987.