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基于PI3K/Akt信号通路探究下调miR-221对肝癌大鼠的干预效果

2024-03-12 81 上传者：管理员

摘要：目的探究基于磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路下调微小RNA-221(miR-221)对肝癌大鼠的干预效果。方法选取43只大鼠，10只作为空白组，其余33只建立肝癌模型，最终有30只建模成功，将建模成功大鼠分为模型组、上调组、下调组各10只。上调组做miR-221过表达慢病毒转染、下调组做miR-221沉默慢病毒转染，空白组、模型组注射生理盐水，观察大鼠变化。结果与空白组相比，模型组、下调组、上调组miR-221、PI3K、Akt表达量、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血清癌胚抗原(CEA)、血清甲胎蛋白(AFP)水平显著上升(P<0.05);与模型组相比，上调组miR-221、PI3K、Akt表达量、VEGF、bFGF、CEA、AFP水平显著上升，下调组miR-221、PI3K、Akt表达量、VEGF、bFGF、CEA、AFP水平显著下降(P<0.05)。结论下调miR-221可抑制肝癌大鼠血管内皮生长因子水平，优化肿瘤标志物水平，其机制可能与PI3K/Akt信号通路被抑制有关。

关键词：
微小RNA-221
微量元素
磷脂酰肌醇-3-激酶
肝癌
蛋白激酶B
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肝癌的发生与缺乏微量元素、肝硬化、生活环境、吸烟、遗传等因素存在联系，其早期临床症状表现为刺痛、腹泻、腹水、食欲减退、肝大、恶性等。目前临床多通过免疫治疗、抗病毒治疗、局部消融、手术等方法对肝癌进行治疗，但其复发率仍较高，因此寻找新的治疗策略对肝癌患者预后具有重要意义[1,2,3,4,5,6]。miR-221在宫颈癌、喉癌、甲状腺癌等多种恶性肿瘤中均呈高表达，可参与肿瘤的发生、发展[7]。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)在鼻咽癌、乳腺癌、大肠癌、肝癌等多种肿瘤中发挥抗凋亡、促增殖的作用[8]。基于此，本文基于PI3K/Akt信号通路探究下调miR-221对肝癌大鼠的干预效果，为肝癌的诊治提供参考。

1、对象与方法

1.1 研究动物

选取43只SPF级Wistar大鼠，体质量160～200 g, 由珠海市丽珠单抗生物技术有限公司提供，动物许可证号：SYXK(粤)2021-0158,所有大鼠在室温23 ℃、湿度50%的无菌笼子中喂养7 d, 本试验操作均参照动物试验伦理要求的相关规定，且经医院伦理委员会批准同意。

1.2 miR-221慢病毒载体构建

采用GenBanK查找序列，获得脂蛋白脂肪酶(LPL)基因序列，构建miR-221沉默、过表达转染质粒，由长沙爱科博生物科技有限公司设计并合成，并设置病毒滴度为1×109TU/ml, 测定慢病毒滴度。

1.3 分组与建模

选取10只大鼠作为空白组，其余33只参照王军等[9]建立模型，将0.5 ml/100 g的二乙基亚硝胺注射入大鼠腹腔内，2次/w, 连续注射4 w, 以大鼠出现精神萎靡、被毛蓬松污秽、眼睛无神、拱背等情况为建模成功，最终有30只建模成功，分为模型组、上调组、下调组各10只。

1.4 miR-221转染

上调组、下调组分别注射10 μl miR-221过表达、沉默慢病毒悬液，空白组、模型组注射同剂量的生理盐水，注射7 d后观察大鼠变化。

1.5 病理学观察

miR-221转染后，麻醉后处死大鼠，获取肝脏组织，进行脱水、石蜡包埋处理，进行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下，对病理形态进行观察。

1.6 miR-221转染效率鉴定

实时荧光定量法鉴定miR-221转染效率，提取肝脏组织总RNA,采用聚合酶链反应(PCR)法鉴定miR-221表达量，使用Primer5.0设计引物序列，反应体系：20 μl蒸馏水，模板DNA 1 μl、0.5 μl上下游引物。反应条件：95 ℃ 15 min、95 ℃ 2 min、50 ℃ 2 min, 60 ℃ 30 s, 共进行45个循环，采用2-△△Ct方法计算出miR-221的表达量。

1.7 生长因子、血清癌胚抗原(CEA)、血清甲胎蛋白(AFP)水平检测

取各组大鼠肝脏组织，放入离心管，将放射免疫沉淀(RIPA)裂解液、蛋白酶抑制剂加入，以12 000 r/min离心处理10 min, 制作组织匀浆，取上层清液，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血管内皮生长因子(VEGF)、bFGF、CEA、AFP水平，将VEGF、bFGF、CEA、AFP标准品稀释，倒入EP管，后加入待测标准品，混匀，后将其倒入空白孔中，室温下孵育90 min, 在孔中加入洗涤缓冲液，重复清洗，后加入50 μl VEGF、bFGF、CEA、AFP抗体，室温下孵育60 min, 加入洗涤缓冲液，重复清洗，加入100 μl SP结合液，封孔，室温下孵育45 min, 加入洗涤缓冲液，重复清洗，后加入100 μl 3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)显色液，450 nm、570 nm下测定吸光度(OD)值。

1.8 PI3K/Akt信号通路蛋白相对表达量检测

采用Western印迹法检测，将各组大鼠肝脏组织放入离心管，将RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂加入，以12 000 r/min离心处理10 min, 制作组织匀浆，取上层清液，使用蛋白质定量法对蛋白浓度测定，后取相同质量蛋白，进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜处理，后采用5%脱脂奶粉进行封管处理，放入4 ℃冰箱中，过夜处理，后进行清洗。加入PI3K、Akt抗体，孵育2 h, 进行清洗，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗，室温下孵育3 h, 凝胶成像系统下观察成像情况，计算恢复值，以GAPDH为内参，对蛋白表达情况分析。

1.9 统计学处理

采用SPSS19.0软件进行配对t检验及F检验。

2、结果

2.1 病理学特征比较

如图1所示，空白组肝细胞无核分裂、细胞完整、大小一致；模型组出现炎性细胞浸润，部分肝细胞坏死；上调组炎性细胞浸润严重，细胞核出现增大；下调组炎性浸润情况明显改善，细胞大小基本恢复一致。

2.2 miR-221转染效率鉴定

如表1所示，与空白组相比，模型组、下调组、上调组miR-221表达量上升，具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比，上调组miR-221表达量上升，下调组miR-221表达量下降，具有统计学差异(P<0.05),说明转染成功。

图1 各组肝脏组织病理特征(HE染色，×400)

2.3 各组生长因子水平对比

如表1所示，与空白相比，模型组、上调组、下调组VEGF、bFGF水平上升，具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比，上调组VEGF、bFGF水平上升，下调组VEGF、bFGF水平下降，具有统计学差异(P<0.05)。

2.4 各组肿瘤标志物水平对比

如表1所示，与空白相比，模型组、上调组、下调组CEA、AFP水平上升，具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比，上调组CEA、AFP水平上升，下调组CEA、AFP水平下降，具有统计学差异(P<0.05)。

表1 各组miR-221转染效率、生长因子、肿瘤标志物水平及肝脏组织PI3K/Akt信号通路蛋白相对表达量比较

2.5 各组肝脏组织PI3K/Akt信号通路蛋白相对表达量

如表1、图2所示，与空白相比，模型组、上调组、下调组PI3K、Akt水平上升，具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比，上调组PI3K、Akt水平上升，下调组PI3K、Akt水平下降，具有统计学差异(P<0.05)。

图2 各组PI3K/Akt信号通路蛋白表达

3、讨论

研究显示[10],miR-221可参与细胞增殖、发育、细胞凋亡、脂肪代谢、造血过程、病毒防御等过程，在宫颈癌、甲状腺癌等多种恶性肿瘤中均呈高表达。在宫颈癌中，miR-221可提高HeLa细胞的增殖能力，且可使癌细胞凋亡减少；在甲状腺癌中，miR-221可促进淋巴结转移，进而促进了患者病情的发展[11]。焦文鹏等[12]研究发现，miR-221在肝癌中呈高表达，且与不良预后、肿瘤大小、临床分期存在密切联系。本研究显示，下调miR-221后可干预肝癌大鼠病情的发展，大鼠炎性浸润情况明显改善，细胞大小基本恢复一致。其机制可能为miR-221可使肝癌上皮-间质转化过程启动，且可靶向脂联素受体(AdipoR)1、植物同源结构域指蛋白(PHF)2,进而促进了肝癌细胞的激活及转移，促进肝癌患者病情的发展，因此经下调miR-221干预后大鼠病情明显改善[13]。

VEGF可通过改善瘤体边缘细胞能量代谢、促进微血管形成、抑制细胞凋亡等促进肿瘤的发生、发展，而肝癌的主要典型特征为大量新生血管形成，因此VEGF在肝癌患者中多呈高表达[14]。bFGF作为一种单链多聚体，对多种细胞的有丝分裂具有促进作用，且对血管生成具有促进作用，可参与肿瘤间质血管新生、侵袭[15]。CEA多由位于泌尿道、胃、呼吸道等空腔脏器肿瘤分泌，在肿瘤状态下，可进入血、淋巴循环，进而导致其水平快速升高[16]。AFP主要由肝细胞、卵黄囊合成，而部分肝外肿瘤、肝细胞癌、胚胎性肿瘤、卵黄囊肿瘤可重新合成AFP,进而导致AFP水平升高[17]。本研究表明，抑制miR-221表达，可使新生血管形成受到影响，且可促进CEA、AFP肿瘤标志物水平的优化。

PI3K/Akt是在肝癌、肾癌、胆管癌、喉癌中均呈异常表达的细胞内外信号连接桥梁[18]。Akt为PI3K/Akt通路重要环节，在磷酸化后可使PI3K/Akt信号通路激活，进而对下游相关基因、旁路信号分子起到了激活作用，调控了细胞迁移、侵袭、增殖、凋亡等过程，同时激活后的PI3K/Akt可促进VEGF、基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-2等因子的表达，进而促进了肿瘤血管的形成、肿瘤细胞的扩散、转移，推动了肿瘤患者病情的发展[19,20,21]。本研究显示，下调miR-221可明显减少新生血管的形成，抑制病情发展，其可能作用机制为下调miR-221可抑制PI3K/Akt信号通路，作用于新生血管形成过程，进而改善了增生，最终抑制肝癌的发展。

综上所述，肝癌的发生可激活PI3K/Akt通路，使机体内VEGF、bFGF、CEA、AFP表达水平升高，促进肿瘤血管的形成，加速疾病的发展，对大鼠机体内miR-221表达量进行抑制，可抑制PI3K/Akt通路的激活，促使大鼠的恢复，表明肝癌的发病机制可能与PI3K/Akt信号通路被抑制有关。

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