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miR-384靶向HMGA2对肝癌细胞生物学行为的影响及其机制
摘要：目的 探讨miR-384靶向高迁移率蛋白A2(HMGA2)对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。方法 对数生长期HUH7细胞分为对照组、miR-384 NC组和miR-384 mimic组，qRT-PCR法检测miR-384表达情况，MTT法检测细胞增殖情况，Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力，双荧光素酶基因报告法检测靶向关系，蛋白印迹法检测HMGA2、上皮钙粘蛋白(E-cad)、神经钙粘蛋白(N-cad)和波形蛋白(Vimentin)相对表达量。结果 人肝癌细胞HEP3 B、BEL-7402和HUH7中miR-384表达水平低于人肝脏正常上皮细胞THLE3中miR-384表达水平。对照组和miR-384 NC组miR-384表达水平、细胞存活率、迁移和侵袭细胞数以及HMGA2、E-cad、N-cad和Vimentin蛋白相对表达量比较，差异均无统计学意义(P>0.05);与miR-384 NC组比较，miR-384 mimic组miR-384表达水平升高，细胞存活率降低，迁移和侵袭细胞数减少，HMGA2、N-cad和Vimentin蛋白相对表达量降低，E-cad蛋白相对表达量升高(P<0.05)。结论 miR-384过表达可抑制肝癌HUH7细胞增殖，降低癌细胞迁移和侵袭能力，其可能是通过降低HMGA2表达，调节上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达发挥作用。
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肝癌是全球范围内常见的一种恶性肿瘤，由于肝癌细胞增殖迅速，且易侵犯门静脉，导致肝内扩散严重，且早期无明显临床特征，因此多数患者就诊时已处于肝癌晚期，临床预后效果不佳，患者5年生存率低下，因此寻找治疗肝癌细胞增殖和扩散的有效靶点和药物至关重要[1,2]。miRNAs是一类广泛存在于真核生物中的非编码RNA,通过与靶基因的3'末端非翻译区结合发挥癌基因或抑癌基因的作用，研究发现，miR-384在肝癌细胞中显著下调，上调miR-384可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，诱导癌细胞凋亡[3]。高迁移率族蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2)在增殖基因的转录调控中具有重要作用，而这一作用可能在肿瘤发生发展中扮演重要角色[4]。研究表明，miR-26a靶向抑制HMGA2表达可降低肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力[5]。此外，HMGA2在肝癌组织中表达明显上调，长链非编码RNA(LncRNA)-ZFAS1通过结合HMGA2可促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭[6]。miR-384是否能通过调节HMGA2表达发挥抗肝癌作用的相关报道甚少，因此本研究通过上调肝癌细胞中miR-384表达，探讨miR-384对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响以及对HMGA2表达的调节作用。
1、材料与方法
1.1 细胞系
肝脏正常上皮细胞THLE3以及肝癌细胞HEP3 B、BEL-7402和HUH7购自美国ATCC公司。
1.2 试剂和仪器
逆转录试剂盒以及PCR试剂盒购自美国Sigma公司；miR-384 NC和miR-384 mimic 由上海生工公司合成；miR-384引物序列由广州锐博生物科技有限公司合成；多功能酶标仪购自美国Bio-Tek公司；倒置显微镜购自日本奥林巴斯；荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。
1.3 qRT-PCR检测miR-384在肝癌细胞中的表达
细胞进行常规培养，取第3代对数生长期细胞进行实验。离心收集细胞，Trizol试剂提取细胞中总RNA,逆转录成cDNA,按照反应体系进行荧光定量PCR反应，miR-384的引物序列见表1。
表1 miR-384引物序列
1.4 MTT法检测细胞增殖情况
将细胞制成单细胞悬液接种于6孔板，置于培养箱中培养，细胞贴壁生长后，每孔20 μl MTT溶液(5 mg/ml)孵育4 h, 弃掉上层培养液，二甲基亚砜(DMSO)150 μl孵育，将细胞置于酶标仪上设置波长为490 nm, 测定吸光度(A)值。
1.5 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力
细胞迁移能力检测：收集细胞，制成密度为5×105个/ml的细胞悬液，在每个小室中加入200 μl细胞悬液，下室中加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基，将小室置于培养箱中培养12 h, 用湿棉签轻轻拭去上室中残余的细胞，多聚甲醛固定30 min, 结晶紫染色20 min, 封片，显微镜下观察细胞数量取平均值。
细胞侵袭能力检测：上室中铺满基质胶，其余操作同上。
1.6 双荧光素酶基因报告法检测靶向关系
TargetScan软件预测miR-384与HMGA2的3' UTR端存在互补的结合位点，将该结合位点序列进行扩增，构建野生型(wt)和突变型(mut)HMGA质粒，将两种质粒分别与miR-384 mimic和mimic NC共同转染入HUH7细胞后进行培养，测定荧光素酶活性。
1.7 蛋白印迹法检测HMGA2、E-cad、N-cad和Vimentin蛋白相对表达量
收集细胞进行裂解，离心收集细胞上清液，测定蛋白浓度，调整蛋白浓度并煮沸变性。每个样本取20 μg蛋白进行电泳，电泳结束后，将蛋白湿转至PVDF膜上，5%胎牛血清封闭，GAPDH、HMGA2、E-cad、N-cad和Vimentin 抗体(1∶1000)4℃孵育过夜，二抗(1∶5000)室温孵育1 h, 洗膜，显色，计算灰度值。
1.8 统计学分析
应用SPSS 21.0软件进行数据分析，计量资料均以描述，进行单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1 miR-384在肝癌细胞中的表达情况
肝癌细胞HEP3 B、BEL-7402和HUH7中miR-384表达水平[(6.19±0.20),(6.44±0.62),(3.19±0.61)]均显著低于肝脏正常上皮细胞THLE3(9.33±0.78)(P<0.05)。
2.2 HUH7细胞转染miR-384结果
与miR-384 NC组比较，miR-384 mimic组miR-384表达水平升高(P<0.05)。见表2。
表2 各组细胞miR-384水平比较
2.3 miR-384过表达对细胞增殖的影响
与miR-384 NC组比较，miR-384 mimic组肝癌细胞存活率降低(P<0.05)。见表3。
表3 各组肝癌细胞存活率比较
2.4 miR-384过表达对细胞迁移和侵袭能力的影响
与miR-384 NC组比较，miR-384 mimic组肝癌细胞中迁移细胞数和侵袭细胞数均减少(P<0.05)。见表4,图1。
表4 各组迁移细胞数和侵袭细胞数比较
图1 结晶紫染色检测细胞迁移和侵袭能力(×400)
2.5 双荧光素酶基因报告法结果
与miR-384 NC+Wt HMGA2组比较，miR-384 mimic+Wt HMGA2组荧光素酶活性降低(P<0.05);miR-384 NC+Mut HMGA2组与miR-384 mimic+Mut HMGA2组荧光素酶活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2,表5。
图2 结合位点和突变位点
2.6 miR-384过表达对细胞中蛋白表达的影响
与miR-384 NC组比较，miR-384 mimic组HMGA2、N-cad和Vimentin蛋白相对表达量降低，E-cad蛋白相对表达量升高(P<0.05)。见图3,表6。
表5 荧光素酶活性比较
图3 蛋白印迹法检测细胞中HMGA2、N-cad、Vimentin和E-cad蛋白表达情况
表6 各组细胞中HMGA2、N-cad、E-cad和Vimentin蛋白相对表达量比较
3、讨论
目前，临床上对肝癌的治疗具有多种手段，主要包括：手术切除、肝脏移植、局部射频消融、经导管肝动脉化疗栓塞术等，但治疗效果并不理想[7]。该恶性肿瘤的病因、发病机制以及新的靶向治疗方法一直是学术界研究的热点和难点。miR-384已被证明在多种恶性肿瘤中具有抑癌作用，例如乳腺癌、鼻咽癌以及肾细胞癌等[8,9]。在肝癌细胞中，Circ-0008285通过靶向作用于miR-384可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭[10]。本研究通过上调肝癌细胞中miR-384表达，探讨其对肝癌细胞的影响及其具体机制。
首先本研究通过检测人正常肝上皮细胞THLE3以及肝癌细胞HEP3 B、BEL-7402和HUH7中miR-384表达水平发现：肝癌细胞中miR-384表达水平显著低于正常肝上皮细胞，其中以HUH7细胞中miR-384降低最为显著。因此本研究通过上调miR-384在HUH7细胞中表达水平，探讨miR-384对肝癌细胞的影响。肝癌细胞向远处器官或淋巴结转移是决定患者预后的关键因素，因此降低肝癌细胞的迁移和侵袭能力对治疗肝癌具有重要的意义[11]。本研究结果显示：对照组和miR-384 NC组细胞存活率、迁移细胞数和侵袭细胞数比较，差异无统计学意义，说明miR-384 NC对细胞增殖、迁移和侵袭能力不产生影响；与miR-384 NC组比较，miR-384 mimic组细胞存活率降低，迁移细胞数和侵袭细胞数减少，说明miR-384可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。
Xu等[12]研究发现，HMGA2在乳腺癌细胞中过度激活，下调HMGA2表达可抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭，阻碍裸鼠乳腺癌移植瘤生长。此外，HMGA2过表达增强结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性[13]。Wang等[14]研究表明miRNA-363-3p通过靶向抑制HMGA2从而发挥抗肝癌作用。由此可见，HMGA2表达水平与肝癌进展密切相关。本研究发现miR-384可直接靶向作用于HMGA2,而且miR-384 mimic组细胞中HMGA2蛋白相对表达量低于miR-384 NC组，说明miR-384靶向抑制HMGA2蛋白表达。上皮间质转化(EMT)是肿瘤细胞发生侵袭和转移的重要基础，E-cad、N-cad和Vimentin是肿瘤细胞发生EMT的标志蛋白[15]。在本次实验中与miR-384 NC组比较，miR-384 mimic组E-cad蛋白表达升高，N-cad和Vimentin蛋白表达降低，说明上调miR-384表达可逆转EMT过程，抑制肝癌细胞侵袭和迁移。
综上所述，miR-384可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，其可能是通过靶向抑制HMGA2从而逆转上皮间质转化过程来发挥作用。
参考文献:
[3]刘皎皎,杨跃青,戴玲,等.microRNA-384靶向HDAC9调控肝癌细胞增殖迁移侵袭和凋亡的机制研究[J].中国中西医结合消化杂志,2020,28(8):573-579.
[5]金若珏,刘三海,黄强,等.microRNA-26a靶向高迁移率族蛋白A2抗体对肝癌细胞增殖及迁移的影响[J].中国基层医药,2021,28(10):1441-1447.
[6]黄维,杨庆,黄江远,等.lncRNA ZFAS1调控HMGA2表达对肝癌细胞增殖､侵袭､迁移的影响[J].现代消化及介入诊疗,2022,27(4):445-450,456.
文章来源:马伟,张空,李梦珂.miR-384靶向HMGA2对肝癌细胞生物学行为的影响及其机制[J].实用癌症杂志,2024,39(03):356-359.
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肝癌属于消化道类恶性肿瘤，根据其发病类型分为原发性及继发性，我国是肝癌发病大国，我国肝癌发病率占世界肝癌发病率的半数[1],是临床高发性恶性肿瘤。并且由于早期肝癌无特异性临床症状，当癌症发展至中晚期才表现出明显症状，大多数肝癌患者确诊时病程已十分严重，基本无法采取手术治疗且癌细胞转移能力较强，进一步导致该病的致死率极高[2,3],是治愈难度较高的一种癌症。
2024-04-27
程序性死亡配体-1(PD-L1)是一种重要的免疫检查点蛋白，它与T细胞上的程序性死亡受体-1(PD-1)接触后会激活共同抑制信号，从而抑制效应T细胞[3]。PD-1/PD-L1轴的生理作用是维持外周耐受与自身免疫之间的平衡，但癌细胞会劫持这一过程，以逃避宿主免疫监视[4]。癌细胞通过表达PD-L1与T细胞上的PD-1相互作用，诱导免疫抑制，从而使肿瘤细胞能在机体内避免T细胞的杀伤[5]。
2024-04-26
原发性肝癌主要由肝细胞癌（75%～85%）和肝内胆管细胞癌（10%～15%）组成，在全球常见癌症中位列第六且为全球癌症死亡的第三大原因，2020年约有90.6万新发病例和83万死亡病例，且最高的发病率往往出现在发展中国家[1]。肝癌的危险因素主要包括HBV或HCV感染、食用黄曲霉毒素污染的食物、大量饮酒、吸烟、超重和糖尿病[2]，在许多地区虽然HBV和HCV的流行率已得到控制，但代谢性因素造成的肝癌相关负担将变得越来越严重[3,4]。
2024-04-24
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1,2]。寻找能改进筛查、诊断和治疗策略的可靠生物标志物，对于改善HCC患者的预后至关重要。DNA损伤是肿瘤进展的一个重要因素，不适当的DNA修复可导致细胞恶性转化[3,4]。瓣状核酸内切酶1(flap endonuclease 1,FEN1）是一种结构特异性多功能酶，在DNA复制和修复中发挥着关键作用，且与癌症的发展有关[5,6,7,8]。
2024-04-22
MDSCs是一类未成熟、异质性的细胞群，包括髓系前体细胞、不成熟的粒细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞（dendritic cell,DC）等[1]。当机体患有肿瘤时，MDSCs可以积聚在荷瘤动物的骨髓、脾脏、肿瘤组织、外周血中以及肿瘤患者的外周血和肿瘤组织中[2,3,4]。近年来，人们发现肝脏也是MDSCs扩增和归巢的器官，并且只要小鼠处于荷瘤状态，即使肝脏没有肿瘤存在，肝脏MDSCs数量仍会增多[2,3]。
2024-04-22
肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌，是全球癌症相关死亡的第四大原因[1]。据估计，2018年约有841 000例HCC新发病例，导致782 000人死亡[2]。HCC较高的发生率和死亡率给医疗系统和患者及其家庭带来了沉重的社会经济负担，成为重大的社会健康问题。
2024-04-22
过去认为伪基因是无功能的基因组化石，随着生物信息学发展，近年发现伪基因广泛参与细胞分化、炎症和凋亡等重要生命活动[1]。研究发现伪基因在乳腺癌、卵巢癌、肝癌等多种肿瘤发生发展中起重要作用，尤其在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移中扮演重要角色[2,3,4]。HCC在全球范围内严重威胁人类健康，预后差，尚无有效治疗方法。
2024-04-22
肝癌是世界上癌症相关发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，尽管目前有许多化疗方法可用于肝癌的治疗，但其在发挥抗肿瘤作用同时会对机体产生一定的毒性作用[1]。迷迭香酸是一种天然多酚类化合物，是迷迭香、肿节风等中药的有效活性成分，具有抗炎、抗氧化、调节免疫等多种药理学活性[2]。
2024-04-18
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是原发性肝癌的主要类型，约占所有病例的90%，其发病率呈上升趋势[1]。近年来，虽然HCC治疗方面的研究取得了重大进展，但其预后仍然不乐观。肝切除术和肝移植被认为是HCC患者获得长期生存的重要手段，但只有10%的患者符合切除条件。
2024-04-14
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是临床常见的恶性肿瘤，多数HCC发现时已经进入中晚期，丧失了手术的机会[1,2]。门静脉癌栓(portal vein tumor thrombus, PVTT)指HCC发生门脉血管浸润，在HCC患者中其发生率约44%～62.2%[3]。巴塞罗那指南中，PVTT的主要推荐是靶向治疗，但肝切除术和经动脉化疗栓塞化疗术(transarterial chemoembolization, TACE)仍是重要的治疗方案[4,5]。
2024-04-09
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期刊名称：肝癌电子杂志
期刊人气：1628
主管单位：国家卫生和计划生育委员会
主办单位：人民卫生出版社
出版地方：北京
专业分类：医学
国际刊号：2095-7815
国内刊号：11-9351/R
创刊时间：2014年
发行周期：季刊
期刊开本：16开
见刊时间：10-12个月
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2024-03-14
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