肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是原发性肝癌的主要类型，约占所有病例的90%，其发病率呈上升趋势[1]。近年来，虽然HCC治疗方面的研究取得了重大进展，但其预后仍然不乐观。肝切除术和肝移植被认为是HCC患者获得长期生存的重要手段，但只有10%的患者符合切除条件。因为大多数HCC患者都是晚期病例，切除术后的HCC患者5年复发率仍高达70%[2]。此外，供肝稀缺是移植治疗面临的问题之一，复发也是移植后的难题。近年来，非手术治疗也逐渐兴起，如血管介入治疗、靶向治疗、免疫治疗等[3,4]，但目前的治疗方法还无法满足临床需求。因此，我们需要开发出有效、低毒的HCC辅助和替代药物，进而为HCC患者提供更多治疗机会，提高生存率。

中医药是中华民族传统文化与智慧的结晶。中药已经在基础研究和临床试验中得到了全面的科学评估，被认为是寻找替代抗肿瘤药物的宝库。因此，从中药中发现治疗HCC的新型药物是一种切实可行的方法。重楼，又名七叶一枝花，是百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎。作为一味传统中草药，重楼最早记载于《神农本草经》，其名蚤休。《中华人民共和国药典（2020年版）：一部》[5]记载重楼的功能与主治为清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊，主要用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、蛇虫咬伤、跌扑伤痛、惊风抽搐。近年来，重楼在临床上被广泛用作抗癌药物，含有重楼的治疗癌症的中成药有金复康口服液、楼连胶囊和软坚口服液等。

重楼皂苷Ⅵ（polyphyllinⅥ）是从重楼中提取的一种活性皂苷，已经被证实对多种恶性肿瘤有强效的抗肿瘤作用[6,7,8,9,10,11]。然而，重楼皂苷Ⅵ对HCC的抗癌作用机制还不清楚，需要进一步深入的研究。本研究旨在探索重楼皂苷Ⅵ对HCC的治疗作用，并研究其可能的作用机制。

本研究利用人肝癌Huh7细胞构建裸鼠移植瘤模型，观察重楼皂苷Ⅵ干预后裸鼠体质量、瘤体体积和质量的变化；进一步通过体外细胞实验检测重楼皂苷Ⅵ对肝癌细胞Huh7和JHH7细胞增殖和细胞周期的影响，以及相关蛋白和基因表达情况；并通过分子对接技术预测重楼皂苷Ⅵ和小核核糖核蛋白D1(SNRPD1）蛋白的潜在靶向结合情况。现将有关结果报道如下。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞

5周龄BALB/c雄性裸鼠，21只，购自上海斯莱克实验动物有限公司。动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。动物饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级动物房，温度为18～29℃，相对湿度为40%～70%。动物实验按照上海中医药大学实验动物伦理委员会的规定进行，并通过审批（伦理编号：PZSHUTCM2211130112）。

人HCC细胞Huh7，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库（货号：SCSP-526）；人HCC细胞JHH7，购自上海盖宁生物科技有限公司（货号：CM-H200）。

1.1.2 药物与试剂

重楼皂苷Ⅵ，上海源叶生物科技有限公司（批号：55916-51-3）；培养基（DMEM高糖）、SNRPD1抗体、TRIzol试剂，美国Thermo Fisher Scientific公司（批号分别为C11995500BT、PA5-12459、15596018）；细胞计数试剂盒（CCK-8），北京爱普拜生物技术有限公司（批号：K101819133EF5E）；放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液，上海碧云天生物技术有限公司（批号：LP0013B);ReverTraAce®qPCRRT试剂盒、SYBR®Green Real time PCR Master Mix试剂盒，东洋纺（上海）生物科技有限公司（批号分别为FSQ-101、QPK201）；细胞周期蛋白D1(Cyclin D1）抗体、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4）抗体、β-肌动蛋白（β⁃actin）抗体，美国CellSignalingTechnology公司（批号分别为55506、12790、3700）；焦碳酸二乙酯（DEPC）、无水乙醇、二甲基亚砜（DMSO）、氯仿、异丙醇，国药集团化学试剂有限公司（批号分别为30061480、10009218、30072418、10006818、40064360）；碘化丙啶/RNA酶（PI/RNase）染色缓冲液，美国BD Bioscience公司（批号：550825）。

1.1.3 主要仪器

-80℃超低温冰箱、NanoDrop超微量分光光度计、细胞培养箱，美国ThermoFisher Scientific公司（型号分别为TSX40086A、ND-2000、51033782）；大容量高速冷冻离心机，德国Hermle公司（型号：Z366K）；低温高速离心机，日本Kubota株式会社（型号：3500）；实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司（型号：StepOnePlus）；倒置显微镜，日本Olympus株式会社（型号：IX83）；酶标仪，美国BioTek公司（型号：Synergy2）；生物安全柜，香港力康发展有限公司（型号：HFsafe-900 LCB2）；电泳仪、电泳槽、转膜仪、凝胶成像系统，上海天能科技有限公司（型号分别为EPS-600、VE-680、VE-386、Tanon 5200）。

1.2 裸鼠移植瘤实验

21只雄性裸鼠，适应性喂养1周。取对数生长期的Huh7细胞，肿瘤细胞以1×107个/只的量接种于裸鼠皮下，构建人肝癌Huh7细胞裸鼠移植瘤模型。接种后每两天观察瘤体生长情况，待瘤体长至70～100 mm3时，按照瘤体大小平均分为3组，即模型组、5 mg/kg重楼皂苷Ⅵ组、10 mg/kg重楼皂苷Ⅵ组，每组7只。采用腹腔注射方式给药，模型组给予药物溶剂（10%DMSO,40%聚乙二醇-300,5%吐温-80,45%质量分数为0.9%的氯化钠溶液），重楼皂苷Ⅵ组给予相应剂量重楼皂苷Ⅵ溶液（用上述药物溶剂溶解），每组给药量为100μL，每日1次，连续给药10 d。

1.3 细胞培养

将Huh7和JHH7细胞置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中，使用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基进行培养，隔天更换1次培养液，2～3 d传代1次，用0.25%胰酶消化后，接种于96或6孔板中，置于培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.4 分子对接实验

通过有机小分子生物活性数据库（PubChem,https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载重楼皂苷Ⅵ的SDF格式文件（3D），利用PyMOL软件转化成pdb格式文件，进行能量最小化处理，转化为PDBQT文件。再从蛋白质结构数据库（PDB,https：//www.rcsb.org/）中下载靶点蛋白（SNRPD1）的PDB文件，利用PyMOL软件对靶点蛋白PDB文件进行预处理，去除包括水分子、杂离子等；利用AutoDockTools工具对处理好的蛋白配体进行加氢、加电荷后，转化并保存为PDBQT文件。参考该蛋白受体与原配体的结合位点，确定对接中心参数，定义盒子大小为30×30×30，运用AutoDock Vina软件进行半柔性分子对接，计算出重楼皂苷Ⅵ与SNRPD1靶点的亲和力（affinity）值。亲和力值越低，则表示小分子与受体结合的可能性越大。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 裸鼠体质量及肿瘤体积

每隔2 d测量裸鼠体质量，同时用游标卡尺测量瘤体的长（a）和宽（b），计算瘤体体积（V）。计算公式：V=0.5×a×b2。10 d后，将裸鼠麻醉，瘤体侧朝上拍照记录，并测量移植瘤体积。随后，将每只裸鼠的瘤体取出，测量并记录瘤体体积和质量。

1.5.2 试剂盒检测细胞增殖

取对数生长期的Huh7和JHH7细胞，以5×104个/孔的密度接种于96孔板，待细胞融合至80%～90%后，用不同浓度（0、1、5、10、15、20μmol/L）的重楼皂苷Ⅵ进行干预，分别于24、48、72 h后加入10%的CCK-8溶液，在细胞培养箱中继续孵育2 h后，用酶标仪在450 nm处测定光密度（OD）值，检测细胞增殖情况。

1.5.3 细胞克隆形成实验

将Huh7和JHH7细胞以800个/孔的密度接种到6孔板中，用不同浓度（0、0.5、1、2、5、10μmol/L）的重楼皂苷Ⅵ进行干预。培养基每3 d更换1次，培养至单克隆细胞数量>50个。用4%多聚甲醛溶液在25℃条件下固定细胞30 min，用结晶紫在25℃条件下染色30 min，在流水下轻柔冲洗结晶紫，置于室温下晾干，用数码相机拍照，观察每孔细胞克隆密度。

1.5.4 Western blot法检测相关蛋白的表达

分别用不同浓度的重楼皂苷Ⅵ（5、7.5、10、12.5、15μmol/L）和同等浓度的DMSO（对照）干预Huh7和JHH7细胞24 h后，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白。蛋白定量后充分变性，上样，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。转膜和封闭后，分别加入目的蛋白一抗（SNRPD1,1∶1 000;Cyclin D1,1∶1 000;CDK4,1∶1 000）和内参一抗（β-actin,1∶3 000),4℃条件下孵育过夜。加入等渗缓冲盐溶液（TBST）洗涤3次，每次10 min。室温二抗（1∶10 000）孵育2 h，加入TBST洗涤3次，每次10 min。采用凝胶成像系统拍摄蛋白条带图片，用ImageJ1.8.0.112软件进行蛋白条带的分析，以β-actin为内参，计算各蛋白相对表达量。

1.5.5 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）法检测相关基因的表达

分别用重楼皂苷Ⅵ（5、10、15μmol/L）和同等浓度的DMSO（对照）干预Huh7和JHH7细胞24 h后，用TRIzol试剂从细胞中提取RNA，按ReverTraAce®qPCR RT试剂盒说明逆转录制备cDNA，进行PCR扩增。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因为内参，检测SNRPD1基因的表达水平。反应条件：95℃预变性1 min，循环1次；95℃变性15 s,60℃退火45 s,72℃延伸30 s，循环40次。每个样本均设3个复孔，进行3次独立重复实验。以2-ΔΔCt法表示各目的基因的相对表达量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。  

表1引物序列  

1.5.6 流式细胞术检测细胞周期

将Huh7和JHH7细胞接种至6孔板中，待细胞长至密度约为80%时，加重楼皂苷Ⅵ干预24 h；利用0.25%胰酶将细胞处理成单细胞悬液，用1 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞团，混匀；滴加预冷的无水乙醇至75%浓度，置于-20℃冰箱过夜固定。第2天，800 r/min离心3 min收集细胞，用预冷的PBS洗涤1次，再次离心并弃去PBS。每个样品用500μL的PI/RNase染色缓冲液重悬细胞，室温避光孵育15 min。使用流式细胞仪分析DNA含量，FlowJo软件进行数据分析。

1.6 统计学方法

研究数据采用GraphPad Prism 8.0软件进行处理与分析。计量资料以表示，符合正态分布的计量资料采用t检验或单因素方差分析，不符合正态分布的计量资料采用非参数检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 对Huh7细胞裸鼠移植瘤生长的影响

Huh7细胞移植瘤裸鼠给药10 d后，重楼皂苷Ⅵ组和模型组裸鼠形态无明显差异，与模型组同期比较，5、10 mg/kg重楼皂苷Ⅵ对裸鼠的体质量无显著影响（P>0.05）；而瘤体大小有差异，重楼皂苷Ⅵ（10 mg/kg）能明显抑制肿瘤体积的增长（P<0.05），对瘤体质量也有抑制作用（P<0.05）。结果表明，重楼皂苷Ⅵ能抑制Huh7细胞裸鼠移植瘤的生长。见图1。

图1各组Huh7细胞裸鼠移植瘤生长的比较 

2.2 对HCC细胞生长增殖和克隆形成的影响

与对照组比较，重楼皂苷Ⅵ（1、5、10、15、20μmol/L）能明显抑制Huh7和JHH7细胞的增殖（P<0.001）。对于Huh7细胞，重楼皂苷Ⅵ的半数抑制浓度（IC50)(24 h）为21.37μmol/L、IC50(48 h）为8.94μmol/L、IC50(72 h）为6.63μmol/L；对于JHH7细胞，重楼皂苷Ⅵ的IC50(24 h）为11.78μmol/L、IC50(48 h）为4.26μmol/L、IC50(72 h）为3.53μmol/L。见图2A。

细胞克隆形成实验结果表明，与对照组比较，5μmol/L的重楼皂苷Ⅵ能明显抑制Huh7细胞的增殖，10μmol/L的重楼皂苷Ⅵ能明显抑制JHH7细胞的增殖。结果表明，Huh7和JHH7细胞株对重楼皂苷Ⅵ的敏感性可能存在差异，因此出现了不同剂量下的治疗效果差异。见图2B。

2.3 对SNRPD1蛋白的潜在靶向作用

分子对接实验结果显示，重楼皂苷Ⅵ可能对SNRPD1蛋白有潜在的靶向作用（affinity=-7.8），见图3A。Western blot结果显示，重楼皂苷Ⅵ（5、7.5、10、12.5、15μmol/L）对SNRPD1蛋白表达有显著抑制作用（P<0.05），并且有浓度依赖关系，见图3B。而RT-qPCR结果显示，重楼皂苷Ⅵ（5、10、15μmol/L）对SNRPD1 mRNA没有抑制作用（P>0.05），见图3C。结果表明，重楼皂苷Ⅵ是通过对SNRPD1蛋白而不是其mRNA的调控，进而发挥抑制肝癌细胞的作用。

2.4对HCC细胞周期的影响

细胞周期实验结果显示，与对照组比较，5、10μmol/L的重楼皂苷Ⅵ均可诱导Huh7和JHH7细胞的周期阻滞，S期细胞减少、G2期细胞增多（P<0.05），并且呈浓度依赖的趋势。见图4。

Western blot结果显示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅵ（5、7.5、10、12.5、15μmol/L）可以明显降低Huh7和JHH7细胞中细胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4蛋白的表达水平（P<0.05）。见图5。

图2对人HCC细胞Huh7和JHH7增殖和克隆形成的影响  

图3对SNRPD1蛋白的潜在靶向作用及对SNRPD1蛋白和基因表达的影响  

3、讨论

HCC是原发性肝癌中发病率最高的类型，是全球癌症相关死亡的第3大原因[12]，也是我国第4大常见恶性肿瘤及第2大肿瘤致死病因[1]。由于其预后不良[13]，严重威胁我国人民的健康和生命。手术切除和肝脏移植是HCC的首选治疗方法，然而大部分患者在发现时已处于中晚期，难以获得根治性治疗。此外，化学疗法、放射治疗、射频消融、经皮乙醇注射、经动脉化学疗法栓塞、靶向治疗和免疫治疗也是HCC重要的治疗方法，然而这些治疗方法都会产生副作用，影响患者的生活质量[14]。因此，开发具有前景和治疗价值的HCC药物以及发现创新治疗靶点至关重要。

随着中药现代化进程的加速，对中药及其活性成分的研究越来越深入，从中药中筛选高效且毒副作用低的药物成为中医药研究领域的热点。近年来重楼的抗肿瘤研究主要集中在重楼的活性成分上，尤其是重楼皂苷[15]。重楼皂苷Ⅵ是重楼的主要活性成分之一，具有抗癌作用。如在肺癌干预过程中，重楼皂苷Ⅵ能诱导G2/M细胞周期阻滞并引发细胞凋亡[6]；通过诱导活性氧（ROS）/核转录因子-κB(NF-κB）/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3）/消皮素D(GSDMD）信号轴诱导Caspase-1介导细胞焦亡[7]；通过ROS触发的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路诱导凋亡和自噬细胞死亡[8]；通过调控ROS/c-Jun氨基端激酶（JNK）和激活p38蛋白诱导肿瘤细胞凋亡和自噬[9,10]；通过Fas死亡途径和线粒体依赖途径诱导人HCC细胞发生凋亡[11]。然而，重楼及其活性成分重楼皂苷Ⅵ的抗肿瘤作用机制仍需要进一步深入探究。

图4对Huh7和JHH7细胞周期的影响  

图5对细胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4的影响  

SNRPD1是一种RNA结合蛋白，参与RNA转录后调控的各个方面。SNRPD1在肝癌[16,17,18]、乳腺癌[19]、卵巢癌[20]、肺癌[21]和胰腺癌[22]中呈高表达，并可作为患者预后生物标志物，抑制SNRPD1的表达能诱导肿瘤细胞阻滞及抑制细胞周期蛋白CyclinD1和CDK4蛋白的表达[16,19]。因此，SNRPD1可作为治疗HCC新的分子靶点。

本研究首先通过体内和体外实验观察了重楼皂苷Ⅵ的抗HCC作用，发现重楼皂苷Ⅵ能抑制Huh7细胞裸鼠移植瘤的生长，抑制人HCC细胞Huh7和JHH7的增殖、克隆。分子对接技术是指通过计算机模拟将小分子（配体）放置于大分子靶标（受体）的结合区域，再通过计算物理化学参数预测二者的结合力（结合亲和性）和结合方式（构象），进而找到配体与受体在其活性区域相结合时能量最低构象的方法[20]，可用于揭示候选天然药物治疗疾病的详细生物靶点和分子机制。为了进一步揭示重楼皂苷Ⅵ的抗HCC作用机制和作用靶点，我们通过分子对接实验，发现重楼皂苷Ⅵ可能能与SNRPD1蛋白直接结合（affinity=-7.8），表明其对SNRPD1蛋白具有潜在的靶向作用。随后在肝癌Huh7和JHH7细胞中也证实重楼皂苷Ⅵ能较好抑制SNRPD1蛋白的表达，但对SNRPD1 mRNA没有抑制作用。这些实验结果提示，重楼皂苷Ⅵ对SNRPD1的调控作用在于蛋白，而不是mRNA。

前期研究[16,19]发现，在癌细胞中敲低SNRPD1基因不仅能抑制肿瘤细胞增殖，还可以诱导肿瘤细胞周期阻滞及抑制细胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4的表达。Cyclin D1是一种重要的细胞周期调控蛋白，其通过与CDK4形成细胞周期依赖性复合物来促进癌细胞的增殖，从而导致包括HCC在内的多种肿瘤疾病的发生。本研究发现，重楼皂苷Ⅵ能降低SNRPD1蛋白的表达水平，推测其抑制HCC细胞增殖可能与影响细胞周期的阻滞有关；重楼皂苷Ⅵ可诱导Huh7和JHH7细胞周期阻滞，并且降低细胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4的表达水平。本研究结果表明，重楼皂苷Ⅵ能靶向抑制SNRPD1蛋白表达，并能调控SNRPD1的下游效应蛋白，这或许是重楼皂苷Ⅵ抗HCC的主要作用机制之一。

本研究发现，重楼中的活性成分重楼皂苷Ⅵ在体内和体外都有较好的HCC抑制作用，并基于分子对接技术发现其能抑制SNRPD1，且能抑制其下游细胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4的表达。本研究结果表明，重楼皂苷Ⅵ是重楼抗HCC作用的重要药效物质基础之一，也是靶向SNRPD1的有效抑制剂。本研究结果为进一步深入研究重楼皂苷Ⅵ抗HCC的作用机制奠定了基础。

参考文献:

[3]李书有.中晚期肝癌的非手术综合治疗[J].医学信息,2022, 35(9):73-75, 80.

[4]段云捷,王成锋.非手术方式治疗大肝癌及巨大肝癌的研究进展[J].中国现代普通外科进展,2022, 25(2):150-155.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2020年版):一部[M].北京:中国医药科技出版社,2020:271-272.

[15]王宇飞,江媛,杨成金,等.滇重楼化学成分､药理作用和临床应用研究进展[J].中草药,2022, 53(23):7633-7648.

基金资助:国家自然科学基金项目(82074101);上海市卫健委临床研究专项(202040486);

文章来源:李茂蓉,张辉.重楼皂苷Ⅵ通过调控SNRPD1抑制肝癌细胞增殖的机制研究[J].上海中医药杂志,2024,58(04):79-85.