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基于H3K27me3修饰探讨砷对肝癌细胞凋亡的影响及作用机制

2024-08-26 37 上传者：管理员

摘要：目的探讨砷剂是否通过调控组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）的表达，进而影响肝癌HepG2细胞凋亡的发生。方法体外培养人HepG2细胞，分为对照组、亚砷酸钠（NaAsO2）组。采用细胞计数法（CCK-8）检测不同NaAsO2浓度、作用时间对HepG2细胞活力的影响，确定培养环境中NaAsO2的最适作用浓度和时间；流式细胞术检测各组HepG2细胞凋亡变化；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组HepG2细胞中组蛋白甲基转移酶（HMT）、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的水平表达变化；Western印迹检测各组细胞中H3K27me3、Jumonji结构域JMJD3（H3K27me3特异性去甲基化酶）、Zeste基因增强子同源物（EZH）2（H3K27me3甲基转移酶）、B细胞淋巴瘤（Bcl）-2、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、细胞凋亡相关基因天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase）3蛋白表达变化。结果与对照组比较，NaAsO2组细胞随NaAsO2浓度的增加，细胞增殖率逐渐下降，根据培养细胞基本增殖要求和实验惯例，选定培养基质中40μmol/L浓度的NaAsO2作用24 h,为NaAsO2抑制HepG2细胞生长的最适条件；与对照组相比，NaAsO2组HepG2细胞的凋亡率显著升高，EZH2、Bax、Caspase3蛋白表达及H3K27me3修饰水平、HMT、SAM表达明显增加，而JMJD3、Bcl-2蛋白表达明显下降（均P<0.05）。结论砷通过调控H3K27me3表达，进而加速肝癌细胞凋亡的发生，砷具有潜在的肿瘤药物治疗价值。

关键词：
乙肝病毒
砷
组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)
细胞凋亡
肝癌
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原发性肝癌是致死率第三的癌症[1],由于我国乙肝病毒携带者众多，导致肝癌的发生呈显著上升趋势，成为影响我国居民寿命的重要环节[2]。肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌中最常见的类型，患者的5年生存率仅10%～12%,急需有效的治疗手段[3]。目前，临床上针对HCC主要以肝切除术、射频消融、血管介入治疗、肝移植及放化疗为主，但效果不显著[4,5]。近年来，中医药被广泛应用于癌症及各类疾病治疗中[6]。三氧化二砷是中药砒霜的主要成分，《本草纲目》曾记载砷具有“蚀痈疽败肉”之疗效。2000年砷被美国食品药品监督管理局批准作为急性早幼粒细胞白血病的一线治疗药物[7],由此可见砷在癌症治疗中发挥着巨大的作用，值得进一步推广。研究发现，砷在治疗HCC中扮演重要角色，砷可抑制肝癌HepG2细胞凋亡，其机制可能与凋亡蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、线粒体膜电位相关[8]。课题组前期研究发现，砷可影响肝细胞中组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)的水平，从而调控肝细胞凋亡的数量[9]。

大量研究发现H3K27me3是疾病发生发展的关键分子，在人类多种癌症中(如前列腺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌及鼻咽癌),与患者预后密切相关[10]。众所周知，在组蛋白去甲基转移酶和组蛋白甲基转移酶(HMT)的共同调节作用下，组蛋白甲基化位点修饰保持其动态平衡，其表达高低直接影响染色质的转录活性[11]。研究发现H3K27me3表达高低受到Jumonji结构域蛋白(JMJD)3(H3K27me3特异性去甲基化酶)和Zeste基因增强子同源物(EZH)2(H3K27me3甲基转移酶)调控[11],在食管癌细胞中过表达EZH2,通过增加H3K27me3表达，调控食管癌细胞的侵袭和转移能力[12];在急性髓性白血病HL-60细胞中过表达JMJD3后，可下调H3K27me3表达，促进抑癌蛋白增加[13]。本课题组前期研究[9]发现，砷剂作用于肝细胞时，砷可调控HMT EZH2和去甲基转移酶JMJD3表达变化，影响H3K27me3的水平，参与凋亡过程中。目前未见研究报道砷作用HepG2细胞后，其对H3K27me3、EZH2、JMJD3的影响。本研究探究砷是否通过调控H3K27me3表达，进而影响HepG2细胞凋亡的发生。

1、材料与方法

1.1材料与实验设备

人HepG2细胞购自中国科学院细胞库，亚砷酸钠(NaAsO2)购自山西西亚化工有限公司。试剂：胎牛血清(以色列BI公司)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、DMEM培养基、胰酶(美国Gibco公司)、双染凋亡试剂盒(南京凯基公司)、蛋白提取试剂盒、彩虹Marker(北京索莱宝公司)、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海酶联公司)、细胞计数法(CCK)-8试剂盒(日本东仁公司)、β-actin、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3抗体(武汉三鹰公司)、H3、H3K27me3、JMJD3、EZH2(美国CST公司)。设备：流式细胞仪(美国贝克曼公司)、倒置显微镜(日本索尼公司)、Western印迹设备、酶标仪(美国伯乐公司)、加样枪(德国Eppendorf公司)、细胞培养箱(美国赛默飞公司)。

1.2细胞培养

HepG2细胞从液氮中取出复苏，按照之前的报道方式培养[14](10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基)。选择细胞指数生长期进行传代，用经1.25%胰酶消化后，以2.5×105个/ml浓度的细胞密度接种到6孔板或96孔板中，置于37℃5%CO2培养箱内培养，待细胞贴壁8 h后，倒置显微镜下观察细胞融合度，融合达30%～40%即可分组实验，将细胞随机分为对照(NC)组、NaAsO2组。

1.3 CCK-8检测细胞活力

为得到NaAsO2作用HepG2细胞的最适浓度和作用时间，采用CCK-8法检测不同浓度和时间下HepG2细胞活力。将生长状态良好的细胞以2.5×105个/ml浓度接种至96孔中(保证铺板是细胞分布均匀，不出现中央聚焦),细胞贴壁后生长至40%左右，加入不同浓度NaAsO2作用细胞0、10、20、30、40、50μmol/L,检测12、24、48 h的细胞活性，每组浓度设置5孔复孔，降低实验误差。细胞达到作用时间后，按照试剂操作说明，加入10μl CCK-8试剂，放置在37℃细胞培养箱孵育1.5 h,使用酶标仪在450 nm波长检测各组细胞光密度(OD)值。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡

同1.2细胞培养，以2×105个/ml浓度接种至6孔中，待细胞贴壁后，加入40μmol/L NaAsO2作用24 h,用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的1.25%胰酶消化后收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，按照凋亡试剂盒操作说明书，每孔加入500μl缓冲液后，再每孔加入5μl碘化丙啶(PI)和异硫氰酸荧光素(FITC)后，混匀后室温避光孵育10 min, 1 h内上流式细胞仪检测。

1.5 ELISA法检测组蛋白甲基化相关酶

细胞培养及分组同1.4,各组细胞达到作用时间后，收集细胞。在酶标板中设置实验孔，各组孔加入细胞裂解液50μl,随后加入辣根过氧化物酶(HPR)标记的山羊抗兔抗体100μl,经孵育、洗涤处理后，加显色剂100μl,室温避光反应15 min,最后加入终止液50μl。使用酶标仪在450 nm波长检测各组细胞OD值，计算各组样本中酶的浓度。

1.6 Western印迹检测蛋白的表达情况

细胞培养及分组同1.4,达到作用时间后收集细胞，配制细胞裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)提取总蛋白，提取蛋白步骤均在冰上进行，防止蛋白降解。蛋白提取后采用BCA法测定各组蛋白浓度，同时将各组样本调整至同一浓度，最后加入5×蛋白上样缓冲液混匀后，100℃金属浴15 min使蛋白变性。每孔40μg上样量，经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，将目的蛋白条带转映到0.45μm的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂牛奶封闭孵育2 h,放置TBST中漂洗3次，每次10 min,加入兔单抗H3K27me3(1∶1 000)、JMJD3(1∶2 000)、EZH2(1∶2 000)、H3(1∶2 000)、Bax(1∶2 000)、Bcl-2(1∶2 000)、β-actin(1∶5 000),4℃摇床孵育过夜，第2天TBST中漂洗3次，每次10 min,放置羊抗兔二抗(1∶10 000)孵育2 h, TBST中漂洗3次，每次10 min,采用电化学发光(ECL)法显色，曝光仪收集图像，ImageJ软件分析目的蛋白灰度值，目的蛋白均重复3次。

1.7统计学分析

采用SPSS21.0软件进行t检验。

2、结果

2.1 NaASO2作用HepG2细胞最适浓度和时间

随着作用时间延长，HepG2细胞活力逐渐下降；与0μmol/L组相比，加入的NaASO2浓度越大，HepG2细胞的活力也随着降低。由CCK-8法检测结果可得NaAsO2作用HepG2细胞的50%抑制浓度(IC50)为40μmol/L、作用时间为24 h,因此得到了NaASO2作用HepG2细胞最适浓度和时间，见表1。

2.2 NaASO2对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

与对照组相比，加砷后HepG2细胞的凋亡率显著升高，Bax、Caspase3蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达明显下降(均P<0.05),见图1、表2、图2。

表1 NaASO2对肝癌细胞最适浓度和作用时间

图1 NaASO2对HepG2细胞凋亡的作用

2.3砷对肝癌HepG2细胞中H3K27me3、JMJD3、EZH2的作用

与NC组相比，NaAsO2组H3K27me3和EZH2蛋白表达明显升高，JMJD3蛋白表达明显下降(均P<0.05),见表2、图2。

2.4 NaASO2对HepG2细胞中HMT、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的影响

与NC组相比，NaAsO2组HMT及SAM表达明显增加(P<0.05),见表2。

与NC组比较：1)P<0.05

表2 NaASO2对HepG2细胞凋亡、凋亡蛋白、HMT、SAM、组蛋白甲基化相关蛋白的影响

图2 NaAsO2对HepG2细胞凋亡、甲基化相关蛋白的影响

3、讨论

当前肝癌治疗多以外科手术合并血管介入治疗为主，辅以靶向药物干预，以延缓患者5年生存率，但治疗效果并不显著，因此急待寻找新的药物治疗途径和分子靶点[15]。砷作为传统中药砒霜的主要成分，其药用价值在早本草纲目中就有记载。近年来，砷广泛应用于癌症的治疗研究中，其中对急性早幼粒细胞白血病治疗效果甚佳，被批准为一线用药。研究证明，三氧化二砷在治疗肝癌、前列腺癌、乳腺癌及消化道肿瘤等方面具有显著的抗肿瘤效[16]。研究发现，砷可通过促进肿瘤细胞凋亡、激活MAPK通路和Hh信号通路调节肿瘤生长、抑制肿瘤分子靶点的耐药性、抑制肿瘤血管的生成、抑制肿瘤转移等多种机制发挥治疗效果[17,18]。本研究发现，加入40μmol/L NaAsO2作用24 h后，HepG2细胞凋亡数量显著升高，这与刘琳等[19]报道一致，研究发现NaAsO2可以下调抑凋亡蛋白Bcl-2、促进促凋亡蛋白Bax表达调控HepG2细胞的凋亡水平。还检测凋亡相关蛋白Caspase-3受砷的影响表达升高，这与邢茂等[20]发现一致，在HepG2细胞中加入NaAsO2后促进线粒体膜电位下降，刺激线粒体释放细胞色素(Cyt)C进入胞质，最终CytC激活Caspase级联反应导致HepG2细胞凋亡的发生。本研究结果认为，砷对HepG2细胞活力具有显著的抑制效果，通过调控凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3的表达促进HepG2细胞的凋亡增加。

大量研究表明，细胞凋亡受到多种途径调控，如表观遗传修饰、MAPK信号通路、促癌或抑癌基因、炎症因子等[21]。Li等[22]研究发现，非编码miR-199a-3p通过靶向PDCD4结合，并抑制其表达从而调控肝细胞凋亡和肝损伤程度。随着后基因组时代到来，以DNA序列不变为基础的表观遗传学调控机制研究应运而生。表观遗传学包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA等[23],组蛋白修饰是表观遗传学的重要组成部分，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等，这些修饰有助于其他蛋白质与DNA结合，从而调控基因转录和表达[24]。组蛋白甲基化参与细胞凋亡的发生，如肖丽容等[25]发现，抑制EZH2的表达可下调H3K27me3水平，从而抑制人B细胞非霍奇金淋巴瘤Raji细胞的生存，促进细胞凋亡发生。本研究推测，砷致HepG2细胞凋亡增加可能与组蛋白甲基化改变有关。

H3K27me3作为组蛋白甲基化的经典位点，在癌症和细胞凋亡中均扮演着重要角色。Wang等[26]研究发现，通过提高H3K27me3的表达水平可以提高结直肠癌患者对奥沙利铂药物敏感性。Zhong等[27]研究发现，H3K27me3可参与调控miR-143的表达，在抑制细胞凋亡和类固醇生成在卵泡闭锁中起关键作用。还有研究报道，H3K27me3参与肝癌的发生发展中，其结果表明HMT EZH2介导的DLC1的H3K27me3表观遗传调控是肝癌转移的重要机制[28]。由此可见，寻找调控H3K27me3表达的有效药物是肝癌治疗的潜在方向。研究表明，H3K27me3的表达受到JMJD3和EZH2的动态调节，因此找到调节JMJD3和EZH2的药物将直接影响H3K27me3的表达[28]。课题组前期研究[9]发现，砷剂作用于肝细胞时，可影响HMT EZH2和去甲基转移酶JMJD3表达变化，促进H3K27me3水平升高，介导线粒体途径凋亡的发生，最终导致肝细胞凋亡。结合课题组前[9]期结果，推测砷可能影响肝癌细胞中JMJD3和EZH2的表达，调控细胞凋亡。本研究提示，砷可作为H3K27me3的激活剂，抑制JMJD3的表达来促进H3K27me3表达。提示当砷作用于肝细胞和HepG2细胞时，细胞凋亡数量均显著增加，且作用机制较相似，砷通过抑制JMJD3表达促进H3K27me3升高，从而调控凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达，促进细胞凋亡的发生。

本研究在细胞模型中证明，砷通过促进H3K27me3表达，加速HepG2细胞凋亡发生，阐释了砷具有治疗HCC的潜在应用价值。但本研究未能在动物模型上进行验证，同时寻找H3K27me3作用的下游分子，这将是本课题组后期研究的主要方向。

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基金资助:贵州省科学技术基金(黔科合基础-ZK[2021]364);贵州医科大学2021年度国基培育项目(20NSP003);