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探究端羧基季铵化壳聚糖抗菌性能与制备方法

2020-07-01 334 上传者：管理员

摘要：以脱乙酰度90%的壳聚糖为原料,采用两步合成方法,得到N,N,N-三甲基壳聚糖(TMC),将TMC与氯乙酸反应,得到端羧基季铵化壳聚糖(CTMC),利用傅里叶变换红外光谱仪和核磁共振氢谱仪对产物进行了表征并研究其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能。结果表明:通过两步法成功合成了CTMC,实现了对壳聚糖分子结构的改性;CTMC的溶解性得到明显提高,其可以溶解于任意pH的水溶液中,且在中性溶液中表现出一定的抗菌性。CTMC的抗菌机理可能主要是带正电的壳聚糖分子链与带负电的细菌细胞壁存在静电作用,改变了细胞壁的通透性,影响细胞内外物质传递从而杀死细菌。

关键词：
CTMC
壳聚糖
抗菌性
抗菌机制
溶解性
结构表征
高分子化学
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壳聚糖（CS）来源广泛，具有无毒、优良的生物相容性和生物可降解性等优点，是应用潜力巨大的天然抗菌剂[1,2]。但是，与传统抗菌剂相比，CS的抗菌活性较低，同时含有大量的氨基和羟基，分子间和分子内含有大量氢键，使得其只能溶于某些酸性水溶液，因而应用受到限制。CS的分子结构中含有大量的氨基和羟基，可以通过与氨基或羟基进行化学反应将一些亲水性基团引入CS的主链中对其进行化学改性，以改善其水溶性和抗菌性能[3,4,5,6,7]。对CS进行修饰改性的方法主要包括烷基化、氨基化、季铵盐化、羧甲基化、酯化、硫脲化等[8,9]。烷基化改性是常用的改性方法且改性反应易于进行。此外，增加CS分子链上氨基的数量或提高正电荷强度，或者引入其他活性官能团来提高其抗菌活性和溶解性也是修饰改性CS的主要方法。借鉴Patrulea等[10]的研究成果，本研究采用两步合成法改性CS，制备了端羧基季铵化壳聚糖（CTMC）；利用多种表征手段对其结构和物理特性进行了分析，并采用平板菌落计数法测试产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能。

1、实验部分

1.1原料与仪器

CS（脱乙酰度>90%，相对分子质量<1×105），分析纯，浙江金壳有限公司；无水乙醇、甲醛、甲酸、丙酮、二甲基亚砜，均为分析纯，成都科龙化工试剂厂；异丙醇，分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；氯乙酸、氢氧化钠，均为分析纯，天津市福晨化学试剂厂；固体培养基，太原科瑞斯克商贸有限公司；大肠杆菌（E.coli,ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（S.aureus,ATCC6538），上海鲁微科技有限公司。

傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR,Nicolet710型），德国布鲁克公司；核磁共振氢谱仪（1H-NMR,AvanceⅢ型400MHz窄腔液体核磁），德国布鲁克公司；扫描电子显微镜（SEM,JSM-6700F型），日本电子公司。

1.2CTMC的制备过程

1.2.1N,N-二甲基壳聚糖的制备

在恒温加热磁力搅拌器中放置150mL的圆底烧瓶，将36mL水、12mL甲酸、8mL甲醛加入到烧瓶中，升温至70℃，加入2gCS回流搅拌118h，再加入一定体积的NaOH溶液沉淀，过滤并反复水洗，冷冻干燥即得淡黄色的N,N-二甲基壳聚糖（DMC）。

1.2.2N,N,N-三甲基壳聚糖的制备

将40mL二甲基亚砜和1gDMC依次加入到100mL圆底烧瓶中，将烧瓶置于恒温加热磁力搅拌器，升温至45℃并将悬浊液搅拌均匀，吸取1mL碘甲烷滴加到烧瓶中，反应12h，冷却至室温，随后用乙醇和丙酮的混合溶液（两者体积比1∶2）沉淀，过滤并用混合溶液洗涤3次，用去离子水透析3d（透析袋截留分子量Mw=3500），冷冻干燥即得白色N,N,N-三甲基壳聚糖（TMC）。

1.2.3CTMC的制备

将30mL异丙醇和0.5g干燥的TMC依次加入到100mL圆底烧瓶中，搅拌均匀后，加入一定量NaOH调节pH=12，室温下搅拌24h，随后将2mL质量浓度0.3g/mL的氯乙酸的异丙醇溶液逐滴滴加到烧瓶中，于45℃氮气氛围下搅拌反应6h，过滤、依次用体积分数70%的乙醇和无水乙醇洗涤，用去离子水透析3d（透析袋截留分子量Mw=3500），冷冻干燥即得白色CTMC产物。

1.3分析与测试

采用傅里叶变换红外光谱仪对产物进行红外光谱测试；采用核磁共振氢谱仪对产物进行核磁氢谱测试；采用扫描电子显微镜观察产物的微观形貌。

溶解性测试：采用吸光光度法测试样品的溶解性，观察1mgCTMC在pH不同的水溶液中的溶解情况，并用酶标仪M3测试溶液在600nm处的吸光度[11]，分析其溶解性，CS与TMC的溶解性测试方法同CTMC。

1.4抗菌实验

分别将纯的第二代大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落移种到50mL灭菌后的固体培养基MH(B）中培养24h，直至菌液变浑浊，离心洗涤3次，然后用磷酸缓冲液（PBS）稀释成一系列浓度梯度的细菌悬液备用。

取4支试管（试管编号为1—4），每个试管中加入PBS缓冲液2.5mL、1×106CFU/mL细菌悬液100μL以及对倍稀释后不同浓度的CTMC2.4mL。编号1—4试管中CTMC的质量浓度分别为1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL，另取1支试管不加CTMC，作为空白对照。将5支试管置于摇床中，于37℃振荡培养24h，然后将混合液涂覆到固体培养基MH(A）平板上，放入37℃培养箱培养24h，观察细菌生长情况。CS与TMC的抗菌实验方法同CTMC。

2、结果与讨论

2.1FT-IR分析

CS、TMC和CTMC的FT-IR谱图见图1。从图可以看出：与CS的FT-IR谱图相比，TMC在1060cm-1和1148cm-1处分别出现了仲胺和叔胺上C—N的伸缩振动吸收峰；在1373cm-1处出现了—CH3的对称伸缩振动峰；在1458cm-1处出现了—CH3的不对称伸缩振动峰。CTMC的FT-IR谱图中既有CS的特征吸收峰，也有TMC的特征吸收峰，而且在1748cm-1处出现了羧酸羰基的CO伸缩振动，在1413cm-1处出现了与羧基相连的—CH2—的变角振动，说明成功地实现了CS的季铵化和羧甲基化改性。

图1CS、TMC和CTMC的FT-IR谱图

2.21H-NMR分析

DMC、TMC和CTMC的1H-NMR谱图见图2。从图可以看出：DMC化学位移δ=2.9处出现的特征峰为仲胺上甲基的氢；在δ=3.1处出现—N(CH3)2基团上甲基的氢；TMC在δ=3.1附近无特征峰，而在δ=3.3处出现了一个新的特征峰，这个峰归属于—N+(CH3)3基团上甲基的氢；CTMC在δ=4.25～4.45之间出现了一个新的特征峰，为—OCH2COOH基团上亚甲基的氢，表明成功合成了CTMC。

图2DMC、TMC和CTMC的1H-NMR谱图

2.3SEM分析

TMC和CTMC的SEM图见图3。从图可以看出，TMC与CTMC在表面微观形貌上存在明显差异，TMC在微观上呈均匀的片层结构，表面光滑致密无裂纹，而CTMC为不均匀的片层结构，表面粗糙有褶皱，比表面积增加。这可能是由于TMC与氯乙酸反应不充分所致，说明反应发生在TMC的表面[12]。

图3TMC和CTMC的SEM图

2.4溶解性能分析

CS、TMC及CTMC分散溶解于不同pH水溶液的照片见图4。由图可知；CS在pH=2的水溶液中澄清透明，CS分散溶解于pH=7,12的水溶液后，溶液比较浑浊，而TMC和CTMC无论是分散溶解于pH=2,7还是pH=12时，溶液均澄清透明。

图5为CS、TMC和CTMC在不同pH水溶液中的吸光度。由图可知，在pH不同条件下，TMC和CTMC的吸光度都较小，在中性环境下CTMC的吸光度最小，表明具有亲水性端羧基的CTMC在中性环境中具有更好的溶解性。

图4CS、TMC及CTMC分散溶解于不同pH水溶液的照片图

图5CS、TMC和CTMC在不同pH水溶液中的吸光度

2.5抗菌性能研究

质量浓度不同的CTMC对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌效果图见图6。从图可以看出：CTMC对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性随着CTMC质量浓度的提高而增强，CTMC质量浓度为500μg/mL时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抗菌效果显著；CTMC质量浓度下降到125μg/mL时对大肠杆菌仍有较为明显的抗菌作用，而对金黄色葡萄球菌则没有明显的抗菌效果。对TMC的抗菌性能也进行了测试，结果显示TMC的抗菌性能比CTMC抗菌性能差。通过对比发现CTMC具有更好的抗菌效果，且对大肠杆菌的抗菌效果比金黄色葡萄球菌的抗菌效果更好。

图6质量浓度不同的CTMC对金黄色葡萄球菌（a1—a3）和大肠杆菌（b1—b3）的抗菌效果图

2.6抗菌机理

基于一般有机抗菌剂的作用机理[13,14,15,16]，我们推测CTMC的抗菌机理主要是作用于细菌的细胞壁。具有良好水溶性和较大比表面积的CTMC有利于与细菌的相互作用，CTMC会吸附在细菌表面，形成一层能够阻挡物质进出的分子膜，影响细菌正常的代谢繁殖，从而杀死细菌。

3、结论

利用两步法成功实现了CS季铵化改性和羧甲基化改性。随着CS氨基季铵化，分子内氢键的作用力被削弱，水溶性得到明显的提高，且溶解性不再受到酸碱条件的限制。抗菌测试结果表明，CTMC抗菌性能明显提高，推测其抗菌机理为带正电的聚合物吸附于带负电的细菌表面，形成一层分子膜阻碍了细菌正常的物质传递，从而杀死细菌。CTMC在临床医药、纺织和环境保护等领域具有潜在的应用前景。

参考文献：

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基金:国家自然科学基金(51703152,31700689);山西省自然科学基金(201701D121044,201701D121030);太原理工大学校青年基金(2016QN87).