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银纳米对不同骨科生物材料上金黄色葡萄球菌生物膜的影响

2024-03-27 49 上传者：管理员

摘要：目的观察银纳米颗粒（silver nanoparticle, AgNP）的抑制细菌生物膜特性，并研究其在常用的3种骨科生物材料上的抑制生物膜作用。方法通过微孔板内药敏试验培养确定AgNP的最低抑制浮游菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC）和最低抑制生物膜浓度（minimal biofilm inhibitory concentration,MBIC）。在钛合金、氧化钛和不锈钢3种骨科生物材料上培养金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）生物膜，使用32、16、8、4、2、0μg/mL AgNP干预生物膜，确定AgNP在3种材料上的MBIC。分析扫描电子显微镜结果，并通过测定光密度值观察AgNP对生物膜形成的影响。结果微孔板内AgNP的MIC和MBIC均为16μg/mL。在对内植物的生物膜抑制实验中，AgNP在氧化钛中MBIC为16μg/mL，在钛合金和不锈钢中MBIC为32μg/mL。3种材料中，氧化钛上光密度值最低，钛合金上光密度值最高。结论 AgNP具有强大的抗细菌生物膜特性，能够在体外阻止金黄色葡萄球菌生物膜形成。钛合金上生物膜形成最多，而氧化钛上最少，不锈钢则介于两者之间。

关键词：
内植物
生物膜
金黄色葡萄球菌
银纳米
骨髓炎
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内植物相关感染是骨科临床工作中的常见问题，研究显示，全髋关节置换术后感染率为2.2%，脊柱手术术后感染率为2.0%[1,2]，使用外固定支架的患者中近一半发生了针道感染[3,4]。对于这种情况，常用治疗方案是手术清创联合抗菌药物。但随着细菌耐药形势愈加严重，抗菌药物治疗效果常常欠佳。当骨科内植物发生感染时，细菌接触并黏附到内植物表面，并分泌细胞外聚合物基质，形成生物膜，而生物膜通过阻碍抗菌药物渗透，将进一步诱导加重细菌耐药性[5]。此类感染通常需要手术去除内植物和死骨。因此，探索一种抑制细菌生物膜形成的内植物材料或涂层的重要性不言而喻。目前已有多种材料包括季铵化合物、铜离子、银离子壳聚糖纳米颗粒等[6,7,8,9,10]被发现有抗菌作用，作为植入物的表面活性物质。银离子已被证明具有较强的抗菌特性，同时银离子还可以制成银纳米颗粒（silver nanoparticle,AgNP），以改善其物理、化学和生物特性[11,12]。因其抗菌及生物特性，AgNP在骨科领域可能用途广泛，骨科植入物表面覆盖AgNP涂层可能是一个骨科内植物感染预防及治疗方案。本研究通过AgNP在体外环境下干预3种内植物材料（钛合金、氧化钛和不锈钢）上的金黄色葡萄球菌生物膜实验来评估AgNP能否预防或治疗骨科内植物感染。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株

金黄色葡萄球菌ATCC 25923，由四川大学华西医院实验医学科临床微生物室提供，已通过基因测序。

1.1.2 AgNP

使用的AgNP为南京新飞纳米材料科技有限公司的银纳米胶体，产品名称：Nano silver胶体银；浓度：0.1 mg/mL；粒子直径：（15±5) nm；溶剂：水。

1.1.3 内植物材料

3种植入物材料分别是氧化钛、钛合金和不锈钢（山东威高控股有限公司提供），大体见图1。所有圆盘半径18 mm，厚度3 mm，经过2 000粒度砂纸抛光，圆盘浸泡在0.2%市售洗涤剂中过夜，更换洗涤剂在40℃的超声波浴清洁5 min，蒸馏水冲洗3次，灭菌，备用。

1.2 实验方法

1.2.1 AgNP对金黄色葡萄球菌浮游菌及生物膜的药敏试验

使用美国临床和实验室标准化协会描述的肉汤稀释方法[13]确定AgNP对金黄色葡萄球菌的最低抑制浮游菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）和最低抑制生物膜浓度（minimal biofilm inhibitory concentration,MBIC），并确定万古霉素对金黄色葡萄球菌的MBIC。菌株复苏后，于新鲜胰酶大豆肉汤中培养2 h，至对数生长期，加入适量新鲜Mueller-Hinton肉汤（MuellerHinton broth,MHB），使用肉汤稀释法制备AgNP溶液浓度梯度，获得64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL的浓度梯度，现用现配。使用麦氏比浊仪将细菌浓度调整至0.5麦氏点（约1×108CFU/mL），将0.5麦氏点菌液使用MHB稀释50倍，现用现配。将细菌溶液加入不同浓度的AgNP-MHB溶液中，比例为50μL菌液与50μL不同浓度梯度的AgNP-MHB溶液。最终细菌初始培养浓度为5×105 CFU/mL。同时建立仅由无菌MHB组成的阴性对照组和仅包含细菌溶液的阳性对照组，每组重复6次实验。37℃静置培养24 h后，肉眼观察MIC。按上述方式，0.5麦氏点菌液稀释100倍，微孔板内每孔加入100μL菌液，37℃静置培养24 h后吸去微孔板内的菌液，无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）轻柔冲洗3次以洗去浮游细菌。每孔加入150μL AgNP-MHB溶液以完全浸没生物膜，AgNP-MHB溶液浓度梯度分别为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5μg/mL，加入不含AgNP的MHB溶液为阴性对照。每组重复6次实验。37℃静置培养24 h，肉眼观察MBIC。以同法测试出万古霉素MBIC，以万古霉素MBIC为阳性对照。吸去微孔板内的菌液，每个微孔内无菌PBS轻柔冲洗3次，自然风干使用结晶紫染色法染色，用多功能酶标仪测定595 nm光密度（optical density,OD）值。

图1 3种内植物材料大体观

1.2.2 扫描电子显微镜（电镜）下观察AgNP对生物膜的影响

使用直径10 mm圆形玻璃盖玻片作为载体培养生物膜，放置在12孔微孔板孔底部。将如前1.2.1所述制备500μL菌液吸入孔中，然后使用AgNP-MHB溶液填充至1 000μL，确保盖玻片完全浸没。AgNP浓度梯度为32、16、8、4、2μg/mL，不含AgNP的无菌MHB为阴性对照，万古霉素MBIC为阳性对照。以与MBIC实验相同的方式培养。培养完成后，盖玻片分别经过3次PBS缓慢冲洗、2.5%戊二醛固定以及梯度乙醇脱水。实验重复2次。使用离子溅射仪在每个盖玻片上喷金染色，扫描电镜[赛默飞世尔（中国）科技有限公司]下观察，随机取视野拍照。

1.2.3 AgNP对各种骨科生物材料生物膜形成的影响

将内植物圆盘置入12孔微孔板中，同1.2.1制备菌液，每孔加入1 000μL菌液，完全浸没圆盘，37℃静置培养24 h，取出圆盘，无菌PBS轻轻冲洗3次，放入新的12孔微孔板内，加入1 000μL不同浓度梯度的AgNP-MHB溶液，AgNP浓度梯度为32、16、8、4、2μg/mL，每种浓度重复6次。37℃静置培养24 h后获得AgNP溶液MBIC，同时测定生物膜OD值。

1.3 统计学方法

使用SPSS 25统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，使用单因素方差分析比较实验组间差异，若有统计学意义则使用Tukey事后检验法进行组间两两比较，并计算两两之间的均数差和95%置信区间。双侧检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 AgNP MIC实验结果

AgNP对金黄色葡萄球菌的MIC为16μg/mL。

2.2 AgNP MBIC实验结果

Ag NP对金黄色葡萄球菌的MBIC为16μg/mL。阳性对照万古霉素的MBIC为64μg/mL。AgNP干预金黄色葡萄球菌生物膜的OD值见表1。

2.3 扫描电镜下观察AgNP抑制细菌生物膜

在没有AgNP的情况下（0μg/mL浓度，阴性对照组），细菌形成大量簇状结构，证明该菌株在没有任何阻碍因素的情况下具有形成生物膜的能力。除去呈蘑菇状的簇状生物膜结构，还观察到大量的浮游菌。在阳性对照组中无明显簇状生物膜形成，但仍然有一定的菌量。在低浓度的AgNP(2μg/mL）干预下，形成的细菌数量没有显著减少，大多数细菌仍然存在于形成的生物膜簇中。在4μg/mL浓度时，尽管周围浮游细菌显著减少，但观察到的情况几乎相同，其中仍观察到生物膜。在8μg/mL时，生物膜形成减少，大量浮游菌仍可见，且有形成菌落的趋势。在作为MBIC值的16μg/mL时，生物膜形成受到明显抑制，浮游菌明显减少。在32μg/mL AgNP的浓度下，未见浮游菌生长。见图2。

2.4 AgNP对不同骨科生物材料上生物膜的影响

AgNP在氧化钛上MBIC为16µg/mL，在钛合金和不锈钢材料上MBIC为32µg/mL。3种材料中，氧化钛上OD值最低，钛合金上OD值最高。在MBIC时，钛合金OD值几乎是不锈钢的2倍，而在低于MBIC浓度下钛合金OD值是氧化钛和不锈钢材料的2～3倍。单因素方差分析显示，在不同的浓度AgNP及阴性对照和阳性对照处理下，3种生物材料上生物膜OD值差异均有统计学意义（P<0.05）。Turkey法两两比较结果显示，在AgNP8μg/mL浓度时氧化钛和不锈钢上OD值比较，两者差异无统计学意义（P>0.05），其余组间两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2、3。

表1 AgNP干预金黄色葡萄球菌生物膜的OD值（n=6)

3、讨论

银已被证明具有根除多种微生物（包括细菌、真菌和病毒）的能力[14]。银通过释放银离子，与细菌的各种成分（如细胞壁、细胞膜和细菌DNA）结合并中断DNA的复制而发挥抗菌作用[15,16]。由于尺寸小，纳米粒子可与周围生物环境相互作用，其中小于100 nm的结构被证明可以改变或增强生物反应[17,18,19]。颗粒的大小和分布决定了AgNP的许多特征，例如毒性、生物学结果和特异性靶向能力[20]。较小的颗粒更容易与细胞和其他身体成分相互作用，能够轻松穿过血脑屏障、细胞壁和细胞膜等结构。本研究选择使用（15±5) nm的颗粒，这一尺寸可以达到理想的效果，文献中使用的颗粒直径范围为5～40 nm[21,22]。

本实验通过扫描电镜发现，AgNP不仅抑制生物膜形成，而且高浓度时还显著降低细菌黏附。值得注意的是，本研究中MBIC和MIC的浓度基本相等，这表明AgNP具有很强的抗生物膜特性。Mala等[23]的研究中AgNP在尿管涂层表面也显示出这种特性。扫描电镜观察显示，在32µg/mL和16µg/mL的浓度下，AgNP显示出了完全的生物膜抑制能力；但随着浓度降低，菌落逐渐增加。在某些研究中，浓度低于50µg/mL的AgNP可以表现出良好的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌生物膜活性[24]。在另一项使用安息香胶提取物形成的AgNP干预大肠埃希菌生物膜研究中，研究者发现AgNP在10µg/mL浓度时就表现出了抗生物膜活性[25]。AgNP抑制细菌生物膜的机制尚不清楚。Qin等[26]在钛内植物表面修饰AgNP的研究表明，AgNP可抑制细菌对内植物表面的黏附，这一作用可能是通过抑制icaAD基因的转录来实现的。

图2 AgNP生物膜处理的扫描电子显微镜结果

表2 不同浓度AgNP时不同骨科生物材料上生物膜OD值比较（n=6)

表3 不同浓度AgNP时不同骨科生物材料上生物膜OD值的两两比较（n=6)

本实验中，我们将MBIC浓度的万古霉素设置为阳性对照。虽然在阳性对照中可以看到抗菌作用，但在同样的浓度与AgNP相比，抑菌效果欠佳。

钛及其变体和不锈钢是最常用的骨科生物材料。钛由于其良好的生物相容性而成为目前应用最广泛的生物材料[27]。Arens等[28]的动物实验研究报道，不锈钢接骨板的感染率远高于纯钛，可能与钛的表面光滑度、表面电荷和疏水性有关[29]。因此，为了获得公正客观的结果，本研究中的所有内植物必须事先抛光以获得均匀的表面光滑度，以尽可能减少由材料表面光滑度引起的误差。Schildhauer等[30]研究表明，与纯钛相比，金黄色葡萄球菌对钛合金的黏附性明显更高。Malhotra等[31]研究也表明，与其他生物材料相比，细菌对钛合金的附着力较高。本研究结果也发现，细菌对钛合金的附着力较高，MBIC为32µg/mL，其生物膜OD值最高；而氧化钛MBIC为16µg/mL，这也表明细菌对氧化钛的附着力较低。氧化钛是通过钛原子电解成四价钛离子，与氧结合，在表面形成氧化层[32]。与钛合金和不锈钢相比，氧化钛OD值最低。钛氧化过程中形成的氧化膜可能是细菌在表面附着减少的原因。Sharma等[33]提出了银纳米与氧化钛的相互作用：氧化钛能促进AgNP释放银离子，从而增加纳米颗粒的杀菌作用，并且具有降低AgNP毒性的能力。这跟我们的结果相符而且能解释为什么氧化钛具有最低的生物膜附着力。

相关临床研究表明，使用银处理医疗器械后细菌污染可有所减少[34,35,36]。Panáček等[37]研究发现Ag NP不同于一般抗菌药物抗感染等机制，使其可作为一种治疗耐药菌株（如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）的有效替代方案。但AgNP的主要缺点是其潜在的毒性，但这还具有争议。大多数研究认为AgNP具有毒性，毒性取决于其大小、形状和浓度[38]。有研究在大鼠中静脉注射AgNP以监测20～100 nm大小颗粒的毒性作用，结果显示脾脏显著增大，T和B细胞数量增加，表明较大的颗粒具有严重的副作用[39]。本研究使用AgNP多在10～20 nm，这一规格的AgNP毒性还需要后续实验继续研究。

综上所述，与氧化钛和不锈钢相比，钛合金上生物膜形成最多，而氧化钛上最少，不锈钢则介于两者之间。AgNP具有很强的抗菌和抗生物膜特性，可有效抑制内植物上的生物膜形成，但其生物毒性还需进一步研究。根据本研究结果，氧化钛最适合进行表面改性，因为它与AgNP的协同作用具有最好的结果。AgNP直接修饰植入物以及它们在体内环境中的行为有待进一步研究。

基金资助:四川省科技计划项目(2018SZ0235);

文章来源:严新安,Walter MChirume,方跃.银纳米对不同骨科生物材料上金黄色葡萄球菌生物膜的影响[J].华西医学,2023,38(07):1047-1052.