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健骨丸对去势大鼠骨质疏松性骨折愈合的影响

2021-09-23 1100 上传者：管理员

摘要：绝经后骨质疏松症是一种与绝经有关的全身代谢性骨病，以骨量减少、骨组织显微结构破坏继而骨脆性增高和易发生骨折为特征[1,2]。我国是PMOP高发地区，女性绝经后10年内骨流失速度较快，60岁以上患有PMOP的女性中，30%～50%将经历PMOP相关骨折，且这种趋势逐年增高[3]。目前临床上常用雌激素类、促进骨形成、抑制骨吸收等药物治疗PMOP相关骨折[4]。中医理论认为肾生骨髓[5]。健骨丸为江苏省中医院院内制剂，其处方基本组成为鹿角、熟地黄、狗脊、黄柏、阿胶、三七、茯苓和六神曲，具有补肾健脾、填精益髓、活络定痛的功效，临床已使用近20年，其疗效确切，常用于治疗绝经期骨质疏松症、男性骨质疏松症等原发性骨质疏松症。本研究通过建立大鼠绝经模型，研究健骨丸对去势大鼠骨质疏松相关指标及骨折愈合的影响[6,7]，以期探讨健骨丸对PMOP所致骨折的治疗作用。

关键词：
健骨丸
去势大鼠
绝经后骨质疏松症
骨形成
骨折愈合
骨质疏松性骨折
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1、材料

1.1动物

清洁级雌性SD大鼠，12周龄，体质量200～220g，由浙江省实验动物中心提供，动物合格证号SYXK2017-0069。动物饲养于SPF级饲养室，12h昼夜交替，温度（21±2）℃，湿度（50±10）%，自由进食饮水。动物实验经江苏省中医院伦理委员会批准（批准号2020DW-34-01）。

1.2药品与试剂

健骨丸（质量标准JSZBZ20090801Z，批号1912010）由江苏省中医院制剂部提供，主要含盐酸小檗碱和三七皂苷；仙灵骨葆胶囊（批号191022103）购自贵州同济堂制药有限公司；钙测定试剂盒（批号20190111）、血清无机磷测定试剂盒（批号20190111）和碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,AKP）测定试剂盒（批号20190106）购自南京建成生物工程研究所；人血清雌二醇（estradiol,E2）放免试剂盒、血清骨钙素（boneglaprotein,BGP）放免试剂盒和降钙素（calcitonin,CT）放免试剂盒购自北京华英生物技术研究所；其他试剂均为市售分析纯。

1.3仪器

Powerwavex340酶标仪（美国Bio-Tek公司）；DiscoverW型双能X线骨密度测量仪（美国Hologic公司）；EclipseE100型光学显微镜（日本尼康公司）；5424R型台式高速离心机（德国Eppendorf公司）。

2、方法

2.1造模、分组与给药

SD大鼠随机分为对照组、模型组、仙灵骨葆胶囊（300mg/kg，相当于临床等效剂量）组和健骨丸低、中、高剂量（150、300、450mg/kg，分别相当于临床最大剂量的0.5、1.0、1.5倍）组，各组再分为给药15d以及30d2组。除对照组外，其余各组进行双侧卵巢切除手术，3个月后右后腿胫骨机械性骨折，建立去势骨质疏松性骨折模型[7]。骨折手术当天，各给药组ig相应药物，对照组和模型组ig等体积0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续15、30d。

2.2健骨丸对去势骨质疏松性骨折大鼠血清中E2、CT、BGP、血钙、血磷水平和AKP活性的影响

分别于给药15、30d，大鼠乙醚麻醉后颈总动脉采血致死，全血于室温放置，分层后4000r/min离心10min，取上层血清，按试剂盒说明书检测血清中E2、CT、BGP、血钙、血磷水平和AKP活性。

2.3健骨丸对去势骨质疏松性骨折大鼠胫骨影像学及骨密度的影响

分别于给药15、30d，采用双能X线骨密度测量仪对各组大鼠右胫骨进行X-射线扫描，并测定骨密度。

2.4健骨丸对去势骨质疏松性骨折大鼠骨折处病理变化的影响

取给药30d大鼠骨折处及其周围组织，于10%福尔马林中固定，脱钙后常规石蜡包埋、切片，进行苏木素-伊红（HE）染色，于显微镜下拍照并观察骨折周围修复情况。

2.5统计方法

使用GraphpadPrism7软件进行数据统计，组间差异使用OnewayANOVA法进行分析。

3、结果

3.1健骨丸对去势骨质疏松性骨折大鼠血清中E2、CT、BGP、血钙、血磷水平和AKP活性的影响

E2是由卵巢内的卵泡细胞分泌的一种甾体雌激素，雌激素降低是导致PMOP最主要的原因[8,9]。如图1-A所示，与模型组比较，给药15d，健骨丸高剂量组血清E2水平显著升高（P<0.01）；给药30d，健骨丸各剂量组血清E2水平均显著升高（P<0.05、0.01、0.001）。

CT是一种钙调节激素，能够通过抑制破骨细胞的增殖并降低破骨细胞的活性，从而降低骨吸收和骨丢失[10]。如图1-B所示，与模型组比较，给药15d，各给药组血清CT水平均显著升高（P<0.05）；给药30d，健骨丸各剂量组血清CT水平显著升高(P<0.05、0.01）。

BGP主要由成骨细胞、骨细胞、骨肉瘤细胞等骨形成性细胞产生，血中BGP水平可特异性反映成骨细胞的活性[11]。如图1-C所示，与模型组比较，给药15d，仙灵骨葆胶囊组血清BGP水平显著升高（P<0.05）；给药30d，仙灵骨葆胶囊组和健骨丸低剂量组血清BGP水平显著升高（P<0.05、0.01）。

AKP是骨细胞功能分化的指标，其活性可作为成骨细胞分化的特异性标志。临床常用AKP活性评价成骨细胞分泌功能[12]。如图1-D所示，与模型组比较，给药15d，健骨丸低、高剂量组血清AKP活性显著升高（P<0.05、0.01）；给药30d，仙灵骨葆胶囊组和健骨丸低剂量组血清AKP活性显著升高（P<0.05、0.001）。

在骨折愈合过程中，局部环境的微量元素代谢活跃，其中钙和磷的沉积是一个关键步骤，两者处于动态平衡的状态[13]。如图1-E、F所示，与模型组比较，给药15d，仙灵骨葆胶囊组和健骨丸各剂量组血钙水平均显著升高（P<0.05、0.001），健骨丸低、中剂量组血磷水平均显著升高（P<0.01、0.001）；给药30d，仙灵骨葆胶囊组和健骨丸低、中剂量组血钙水平均显著升高（P<0.05），各给药组血磷水平均显著升高（P<0.05）。

3.2健骨丸对去势骨质疏松性骨折大鼠胫骨影像学及骨密度的影响

骨质疏松性骨折的愈合过程通常包括纤维、软骨及骨性骨痂的形成。骨痂的形成对骨折愈合至关重要，反映了骨组织再生修复的自然规律，也是临床判断骨折愈合程度的重要依据[14,15]。如图2所示，给药15d，各给药组断面有骨痂生成；给药30d后，各给药组断面有大量骨痂形成，其中健骨丸中、高剂量组生成骨痂量多于模型组。健骨丸各剂量组骨折愈合情况较模型组有明显改善。

骨密度即骨骼矿物质密度，反映骨骼强度，也是诊断骨质疏松症、骨质疏松性骨折以及骨折愈合程度的重要指标[16,17]。如图3所示，给药15、30d，与模型组比较，各给药组骨密度均显著升高（P<0.05、0.01、0.001）。

3.3健骨丸对去势骨质疏松性骨折大鼠骨折处病理变化的影响

如图4所示，与模型组相比，健骨丸各剂量组断端骨痂中骨性骨痂的成分增多，骨小梁的粗细及骨髓腔的大小与对照组相似。

4、讨论

在中医理论中，女性绝经主要是因肾气渐衰、冲任不足、天癸将竭、精气亏虚、阴阳失衡所致。中医理论认为肾与骨有着极其密切的联系，《素问·阴阳应象大论》曰：“肾生骨髓”，即肾中精气充足，骨髓得以滋养，骨则强壮[18,19]。

健骨丸为江苏省中医院临床验方制成的院内制剂，其处方基本组成为鹿角、熟地黄、狗脊、黄柏、阿胶、三七、茯苓和六神曲。方中鹿角、狗脊共为君药，鹿角性温，归肝、肾经，有温肾阳、强筋骨之效；狗脊性甘、寒，归肝、肾经，有补肝肾、强腰脊之功效；熟地黄、阿胶共为臣药，熟地黄性微温，归肝、肾经，有填精益髓之效，为补肾阴之要药；阿胶性平，归肺、肝、肾经，有补血、滋阴、止血之功效；佐以黄柏苦寒坚肾，三七散瘀止痛，茯苓、六神曲健脾宁心，诸药合用，共奏补肾健脾、填精益髓、活络定痛之功，在临床上对绝经期骨质疏松症有确切疗效。

本研究以仙灵骨葆胶囊为阳性对照药物，通过建立去势大鼠模型，探讨健骨丸对去势大鼠骨质疏松性骨折愈合的影响。结果显示，健骨丸能够增加去势骨质疏松模型大鼠血清E2水平。雌激素降低是导致PMOP的重要原因之一，E2是活性最强的雌激素，E2水平的降低会抑制成骨细胞活性并增强破骨细胞活性，导致骨密度降低，骨量丢失增多。健骨丸通过升高E2水平，增加骨密度，促进成骨细胞增殖，抑制骨吸收，保护骨组织，防止骨丢失。在骨折愈合过程中检测AKP具有重要意义，AKP的含量变化可反映骨折区细胞增殖的程度以及骨折愈合演进的状况。血中40%～50%AKP来源于骨，AKP的活性可反映骨细胞尤其是新形成的成骨细胞的活性及状态。本研究结果显示，健骨丸可提高血中AKP活性，提示健骨丸可以提高成骨细胞活跃度，促进骨形成增加。血中CT、BGP水平也是反映成骨细胞活性的特异性指标，本研究结果显示，健骨丸可以提高血清CT、BGP水平，促进骨形成；此外，健骨丸能够增加血钙、血磷水平，促进骨基质的钙化，形成骨质[6,20,21,22]。

结合X-射线扫描、骨密度及病理组织学结果可知，健骨丸可以通过提高骨折端骨密度来增加骨骼强度，从而促进骨折愈合；同时，骨折断端已由增生的纤维结缔组织、软骨、松质骨形成的骨痂连接。与对照组比较，模型组大鼠骨痂内松质骨骨髓腔较大，表现为明显的骨质疏松现象；各给药组骨髓腔形态基本正常，由去势诱导的骨质疏松症状明显缓解；健骨丸各剂量组骨小梁表面可见活跃增生的成骨细胞，小梁之间已有骨髓腔形成，部分增生的结缔组织内尚可见丰富的毛细血管，骨痂内软骨数量不等。健骨丸可使机械损伤的骨折断端骨痂明显增多，成骨细胞增生活跃，骨折愈合良好[8,23]。健骨丸各剂量组未体现明显的剂量相关性，这可能是受多组分的药物代谢影响。本研究结果提示，健骨丸对于其他适应症的临床指导用量（成人10～15g/d）也可作为修复绝经引起的骨质疏松性骨折的临床使用剂量。

本研究通过测定去势大鼠血清中E2、CT、BGP、AKP、血钙、血磷等生化指标，结合X-射线扫描、骨密度检测以及病理组织学方法，表明健骨丸具有促进绝经引起的骨质疏松性骨折的骨形成以及骨折愈合的功效。课题组后续将深入探究其可能的作用机制。

参考文献：

[1]叶丹.骨质疏松药物治疗的研究进展[J].牡丹江医学院学报,2021,42(1):148-151.

[2]胡广,关智宇,张开伟.三七总皂苷干预去势骨质疏松性骨折模型大鼠的作用机制[J].中国组织工程研究,2021,25(2):172-177.

[3]李春君,于德民,于倩.骨质疏松治疗的研究进展[J].药品评价,2013,10(5):35-39.

[4]李章青.补肾化痰方对去势骨质疏松大鼠脂/骨代谢影响的实验研究[D].武汉:湖北中医药大学,2020.

文章来源：刘炜,罗会盛,邹恺平,王娜,刘顺,施敏.健骨丸对去势大鼠骨质疏松性骨折愈合的影响[J].中草药,2021,52(18):5615-5619.