无菌性假体松动(aseptic prosthesis loosening)是指人工关节假体在无感染或外部创伤的情况下骨骼之间发生松动[1]。磨损颗粒造成假体周围骨质溶解是假体无菌性松动的主要原因之一[2],它可引起假体与骨界面细胞功能的变化，诱发多种炎性细胞因子及趋化因子的产生，改变假体周围微环境，扰乱成骨细胞、破骨细胞及免疫细胞等局部细胞平衡，最终造成假体与骨骼整合失败，假体丧失功能[3,4,5,6]。新近研究表明，肠道益生菌可以减少肠道炎性反应，改善肠道通透性，防止骨丢失[7]。牛蒡子是一种药食同源的植物，源于菊科草本植物牛蒡的干燥成熟果实，其主要的活性成分是牛蒡子苷(ARC),近年来研究证实ARC具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用[8,9,10,11]。本研究通过观察ARC干预钛颗粒诱导骨溶解模型小鼠后骨量、炎性因子及肠道菌群的变化，探讨ARC对钛颗粒诱导颅骨周围骨溶解的作用机制，为临床治疗骨溶解性疾病提供新的思路和方法。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：

选取7周龄C57BL/6J雌性小鼠20只(由南方医科大学提供),许可证号：SCXK(粤)2016-0041。置于SPF级环境中，采用标准化饲养，小鼠自由进食。本实验已获得广东药科大学附属第一医院伦理委员会批准(批准号：00290044)。

1.1.2药物与仪器：

ARC购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98 %,CAS:20362-31-6;纳米级钛颗粒(上海贤鼎生物科技有限公司，批号：7440-32-6);ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司，批号：20220112M);生理盐水(科伦，批号：国字准号H20083400);Micro-CT型号：SCANCO uCT 100(杭州越波生物科技有限公司);PCR仪：ABI GeneAmp®9700型(应用生物系统公司，美国)。

1.2方法

1.2.1分组、建模与给药：

将20只小鼠随机分为空白组(SHAM)、骨溶解模型组(Vehicle)、ARC低剂量组(L-ARC)及ARC高剂量组(H-ARC),每组5只。除SHAM组外，其余三组用钛颗粒建立小鼠颅骨骨溶解模型[12,13]。将ARC溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，浓度分别为0.25 g/L和0.5 g/L。术后第2天，L-ARC和H-ARC组分别给予ARC 5 mg/(kg·d)和10 mg/(kg·d)腹腔注射，SHAM组和Vehicle组以等剂量生理盐水腹腔注射，持续14 d。

1.2.2头颅Micro-CT扫描：

实验结束后，取出完整头颅并剔除其周围附着的组织，采用Micro-CT仪对其进行扫描。扫描参数：70 kV(电压),200μA(电流),20μm(分辨率),300 ms(曝光时间)。扫描完成后，以颅骨中线缝合线周围的区域作为正方形感兴趣区域(region of interest, ROI)行三维重建，并分析骨密度(bone mineral density, BMD)、骨体积分数(bone volume/tissue volume, BV/TV)、骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)、骨表面积骨体积比值(bone surface/bone volume, BS/BV)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)和骨小梁分离度(trabecular separation, Tb.Sp)。

1.2.3血清ELISA测定：

末次给药后24 h,通过摘除小鼠眼球法采集其血液样品。为了获得血清样品，离心条件被设定为4℃下的6 000 r/min,时间为10 min,以分离出上清液，用于后续分析和实验操作。ELISA检测血清中抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase 5b, TRACP5b)、I型胶原交联C-末端肽(C-terminal telopeptide of type I collagen, CTX)、骨钙素(osteocalcin, OCN)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)水平。

1.2.4小鼠粪菌总DNA的提取与16S rRNA扩增子测序：

刺激小鼠排便并放入1.5 mL无菌EP管中，置于-80℃冰箱保存。抽提粪菌样本DNA,并测定其浓度和纯度。以此DNA为模板进行PCR扩增，回收并纯化同一样本的PCR产物，检测定量、建库，在美吉生物云平台(https: //cloud.Majorbio.com)测序及分析。

1.3统计学分析

用R软件处理实验数据，组间差异分析采用Wilxocon秩和检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 Micro-CT图像及指标的变化

SHAM组小鼠颅骨表面光整，Vehicle组小鼠颅骨骨组织结构破坏、骨连接中断，经ARC干预后小鼠颅骨侵蚀破坏减轻(图1)。与SHAM组相比，Vehicle组BMD、BV/TV、Tb.N、BS/BV和Tb.Th显著降低(P<0.01,P<0.05),Tb.Sp显著升高(P<0.05);与Vehicle组相比，L-ARC组BMD、BV/TV、Tb.N、BS/BV和Tb.Th有升高趋势、Tb.Sp有降低趋势(P>0.05);H-ARC组BMD、BV/TV和Tb.N显著升高(P<0.05),BS/BV和Tb.Th有升高趋势、Tb.Sp有降低趋势(P>0.05)。见图2。

图1 Micro- CT图像  

2.2小鼠血清ELISA指标的变化

与SHAM组相比，Vehicle组骨吸收指标TRACP5b、CTX、促炎因子TNF-α和IL-6水平显著升高(P<0.05,P<0.01),骨形成指标OCN、抗炎因子IL-10水平显著降低(P<0.05,P<0.01);与Vehicle组相比，L-ARC组TRACP5b、CTX有降低趋势(P>0.05),OCN有升高趋势(P>0.05),TNF-α和IL-6显著降低(P<0.05),IL-10显著升高(P<0.05);H-ARC组TRACP5b、CTX、TNF-α和IL-6水平显著降低(P<0.05,P<0.01),IL-10水平显著升高(P<0.01),OCN有升高趋势(P>0.05)。见图3。

2.3各组小鼠肠道菌群的变化

Shannon曲线趋于平缓，提示测序数据量足够(图4A);图4B、4C表明SHAM组与Vehicle组样本整体上有明显区分，表示两组肠道菌群结构差异显著，经ARC治疗后与Vehiche组样本明显区分，提示ARC对颅骨骨溶解模型小鼠肠道菌群有改善作用。大多数丰度较高的菌在门水平上多集中在厚壁菌门(firmicutes)和拟杆菌门(bacteroidota),占总体水平的90 %以上(图4 D);与SHAM组相比，F/B率在Vehicle组中有增加趋势，但无显著差异(P>0.05),与Vehicle组相比，L-ARC和H-ARC组F/B率显著性降低(P<0.01)(图4E);在属水平，与SHAM组相比，Vehicle组Ileibacterium丰度有增加的趋势(P>0.05),Prevotellaceae_UCG-001和Rikenellaceae_RC9_gut_group丰度有降低趋势(P>0.05);与Vehicle组相比，经ARC干预后，Ileibacterium丰度显著降低(P<0.05),Prevotellaceae_UCG-001和Rikenellaceae_RC9_gut_grou丰度显著增加(P<0.05)(图4F)。

图2 Micro-CT指标的变化  

图3 ARC对各组小鼠血清指标的影响  

图4 ARC对各组小鼠肠道菌群的影响  

3、讨论

无菌性假体松动是人工关节置换术后中、晚期常见的并发症，目前临床尚无确切有效的治疗药物。磨损颗粒与假体松动密切相关，可导致假体周围骨溶解及骨吸收加剧[2]。因此，分析药物对假体周围骨溶解及骨吸收的作用，具有重要的临床意义。ARC是中药牛蒡子的主要活性成分，具有显著抗炎、抗氧化的作用[8,9,10,11],同时Chen等[14]发现ARC以剂量和时间依赖性的方式抑制破骨细胞的形成，进而抑制骨吸收。目前尚无研究报道有关ARC对骨溶解模型的作用，基于此本研究观察了ARC干预骨溶解模型小鼠中骨量、炎性因子及肠道菌群的变化，以期为后期临床应用提供一定的实验依据。

人工假体组件产生的磨损颗粒作用于假体周围组织的各种细胞，单核-巨噬细胞吞噬磨损颗粒的同时分泌炎性细胞因子，如TNF-α和IL-6等，诱发慢性炎症并进一步促进破骨细胞的生成，抑制成骨细胞的形成及功能并最终造成假体周围骨质的丢失[15]。Ren等[16]在体内研究中发现，对于巨噬细胞和破骨细胞的分化以及定向移动，磨损颗粒起到至关重要的作用。磨损颗粒可直接或间接对破骨细胞的数量产生影响，例如钛颗粒能够直接通过改变前体细胞内部的信号传导机制，促进破骨细胞的成熟，又可间接诱导巨噬细胞释放炎性因子来加速破骨细胞的成熟过程[17]。TRACP5b是一种活性酶，由破骨细胞分泌，可通过测量其水平评估骨吸收的程度[18]。CTX是骨吸收的代表性指标，能反映溶骨性变化，其升高与破骨细胞活性呈正相关[19]。OCN由成骨细胞分泌，是骨形成敏感标志物之一，其升高趋势与骨形成速率趋势一致[19]。本实验发现，植入钛颗粒后，小鼠颅骨被广泛侵蚀，甚至出现部分骨连接中断，经H-ARC干预后小鼠颅骨侵蚀明显减轻，同时颅骨BMD、BV/TV和Tb.N均显著升高，TRACP5b和CTX水平显著降低，提示ARC能够抑制破骨细胞的分化和活性，延缓人工假体磨损颗粒引起的骨溶解，改善骨微结构，增加BMD,且呈剂量依赖性。赵旭红等[20]发现，与首次膝关节置换者相比较，假体松动时滑膜液中IL-6和TNF-α表达明显上调。TNF-α和IL-6可直接或间接作用于破骨细胞及其细胞膜上的受体，促进破骨细胞分化和成熟，导致骨吸收增加[21]。IL-10诱导的成骨样细胞上清液可显著抑制RAW264.7向破骨细胞分化[22]。本研究结果显示，Vehicle组小鼠血清中TNF-α和IL-6水平显著升高，IL-10水平显著降低，经ARC干预后TNF-α和IL-6水平显著低于Vehicle组，IL-10水平显著高于Vehicle组，提示ARC可通过抑制炎性反应改善钛颗粒引起的骨溶解。

肠道微生物的组成和功能与骨代谢紧密相关。肠道微生物可以通过多种途径影响骨健康，其中最重要的是它们对骨吸收和骨形成的调节[23,24,25]。低Bacteroidota含量的绝经后骨质疏松患者骨折风险更高[26],Firmicutes具有免疫调节、促进破骨细胞分化的作用[27]。本实验显示ARC可显著降低钛颗粒诱导骨溶解模型小鼠F/B率，抑制骨吸收。Ileibacterium属于肠道有害菌，与炎症性肠病密切相关[28]。Prevotellaceae_UCG-001属Prevotella菌属，给予小鼠Prevotella灌胃可抑制小鼠全身和局部颅骨炎症，并通过调节RANKL/OPG比值减少钛颗粒诱导的骨溶解[29]。HHPC(高取代羟丙基纤维素)干预结肠炎模型小鼠后，Rikenellaceae的丰度有增加趋势，说明Rikenellaceae与炎症反应呈负相关[30]。与上述研究一致，本实验中，钛颗粒诱导骨溶解模型小鼠Ileibacterium丰度有增加趋势，Prevotellaceae_UCG-001和Rikenellaceae_RC9_gut_group丰度有降低趋势；ARC干预后可有效纠正这种菌群紊乱，促进有益菌且抑制有害菌生长，提示Ileibacterium、Prevotellaceae_UCG-001及Rikenellaceae_RC9_gut_group可能是H-ARC抑制钛颗粒诱导骨溶解的靶点菌。

综上所述，ARC可能是通过抑制炎症反应、调节肠道菌群结构减轻钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解，并且呈现剂量依赖性。当然，本研究尚存在一定局限，未反向验证Ileibacterium、Prevotellaceae_UCG-001及Rikenellaceae_RC9_gut_group对骨溶解模型的作用，后续将继续开展这方面相关研究。

参考文献:

[2]刘鹏,邓亚鹏,曹国定,等.人工关节置换术后假体无菌性松动的研究进展[J].中华关节外科杂志(电子版),2020,14(3):346-351.

[4]肖跃军,安森博,韩斐,等.姜黄素调节核转录因子-κB信号通道抑制磨损颗粒诱导骨溶解[J].中华实验外科杂志,2018,35(8):1494-1496.

[8]冯婉琳,李婧.牛蒡子的化学成分及心血管药理研究进展[J].内蒙古医科大学学报,2022,44(1):101-104,112.

[9]边巴次仁,尼玛仓决,赤列旺久,等.中草药牛蒡子化学成分及药理研究进展[J].中国兽药杂志,2018,52(9):67-74.

[10]王鹏程,杨扬,崔明珠,等.牛蒡子苷元调控CTRP6对七氟烷麻醉后大鼠炎症反应和认知功能障碍的影响[J].中医学报,2022,37(1):149-155.

[11]雷俊.牛蒡子苷元抑制TLR4/TRAF6/NF-κB信号通路对哮喘模型大鼠气道重塑和Th1/Th2免疫平衡的影响[J].免疫学杂志,2023,39(1):12-20.

[12]朱世军,徐耀增,崔京福,等.雷尼酸锶对钛颗粒诱导炎性骨溶解的抑制作用[J].骨科,2014,5(2):65-68.

[13]陈德胜,李燕,郭凤英,等.钛颗粒刺激小鼠颅骨诱导骨溶解的动物模型建立[J].宁夏医学杂志,2018,40(8):677-680,672.

[17]王来潮,宋科官.磨损颗粒诱导假体无菌性松动的研究现状[J].中国矫形外科杂志,2013,21(18):1837-1840.

[18]李晓双.抗酒石酸酸性磷酸酶5b的临床应用[J].中国骨质疏松杂志,2010,16(11):872-875,846.

[19]《中国骨质疏松杂志》骨代谢专家组,张萌萌,马倩倩,等.骨代谢生化指标临床应用专家共识(2023修订版)[J].中国骨质疏松杂志,2023,29(4):469-476.

[20]赵旭红,伍骥,李松林等.全膝关节置换假体松动时滑膜液中的诊断性标志物[J].中国组织工程研究,2013,17(26):4782-4788.

[21]秦立武,王友强,谭训香,等.补肾健骨方对假体松动炎性因子IL-1､IL-6､TNF-α抑制的实验研究[J].中国中医骨伤科杂志,2015,23(8):11-13.

基金资助:广东省云浮市科技计划项目(2020A090402);

文章来源:唐琳,谢佑红,周天宇,等.牛蒡子苷经炎性因子和肠道菌群抑制钛颗粒诱导骨溶解的机制[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(06):847-852.