脆性骨折是绝经后骨质疏松症患者的严重并发症，因高转换型骨代谢的特点导致其愈合困难、愈合时间延长[1],严重影响患者生存质量，并带来巨大经济负担[2,3]。如何改善绝经后骨质疏松性骨折(postmenopausal osteoporotic fractures, PMOPF)愈合是目前临床高度关注的问题。龟鹿二仙胶出自《医方考·虚损劳瘵门》,功效为补肾强骨、填精益髓。前期研究表明，龟鹿二仙胶可促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，明显改善去卵巢大鼠骨显微结构，提升骨密度(bone mineral density, BMD)和骨强度[4,5]。在此基础上，本实验以去势后骨质疏松合并股骨骨折内固定大鼠为研究对象，观察龟鹿二仙胶对其骨折愈合情况、骨折处最大载荷及对骨代谢相关指标的影响。

1、材料

1.1 动物

SPF级雌性SD大鼠34只，12周龄，体质量120～150 g, 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，质量合格证编号：SCXK(沪)2022-060。大鼠饲养于福建中医药大学动物实验中心，湿度50%～60%,12 h/12 h明暗交替，自由进食和饮水。本实验经福建中医药大学动物伦理委员会审核批准，伦理审批编号：FJTCM IACUC 2022074。

1.2 药物与试剂

鹿角胶、龟板胶、枸杞子、人参(康仁堂药业有限公司，批号：21017861、20045271、23029751、0723011391);阿仑膦酸钠片(石药集团欧意药业有限公司，批号：H10980109);苏木素-伊红染色试剂盒、改良番红固绿软骨染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：G1120、G1371);骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase, BALP)、骨钙素(bone gamma carboxy-glutamic acid containing proteins, BGP)、Ⅰ型胶原交联C-末端肽(type I collagen carboxy-terminal peptide, CTX-1)ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，批号：CSB-E11865r、CSB-E05129r、CSB-E12776r);RN54-EASYspin Plus骨组织RNA快速提取试剂盒(Aidlab, 批号：RN5401);HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme, 批号：R223-01);SYBR-Premix Ex TaqTM(日本Takara公司，批号：RR420A);超敏ECL化学发光试剂盒(新赛美生物科技有限公司，批号：P10300);BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司，批号：P0012S);BGP抗体、BALP抗体、骨细胞特异性转录因子(Osterix)抗体(Affinity Biosciences, 批号：DF12303、DF6225、DF7731);GAPDH抗体、抗兔IgG HRP- linked抗体(美国CST,批号：5174S、7074S)。

1.3 仪器

电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，型号：AL204);万能材料试验机(岛津，型号：AG-IC 20KN);XRAY-Imaging型小动物X光机(美国KUBTEC公司);石蜡包埋机(湖北锦源医疗科技有限公司，型号：JY-BMC);病理切片机(美国Thermo公司，型号：HM-325);Gmbh型倒置显微镜系统(德国徕卡显微系统有限公司);实时荧光定量基因扩增仪(美国Bio-rad公司，型号：CFX96)。

2、方法

2.1 药物制备

龟鹿二仙胶(药物组成：鹿角胶 6 g, 龟板胶9 g, 枸杞子9 g, 人参6 g)由康仁堂药业有限公司制备配方颗粒，其中鹿角胶和龟板胶的浓缩比例为1：1,人参和枸杞子的浓缩比例为1：5。将龟鹿二仙胶颗粒使用生理盐水配成质量浓度为0.455 g·mL-1的药液。将阿仑磷酸钠片研磨成粉，使用生理盐水配成质量浓度为0.25 g·L-1的药液。

2.2 PMOPF模型制备

大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液进行麻醉(10 mL·kg-1),碘附消毒腹部皮肤，打开腹腔，行双侧卵巢切除术。术后12周，随机选取5只大鼠，使用双能X线法检测全股骨BMD。大鼠骨质疏松模型建立成功后，行右侧股骨骨折合并髓内针固定术[6]。麻醉方法同上，大鼠取左侧卧位，以右侧大腿中点为中心，沿大腿外侧做平行于股骨纵轴的切口；沿股外侧肌和股二头肌外侧间隙分离至股骨表面，使用电动锯片(直径2 cm, 厚度0.1 mm)垂直切割(2 500 r·min-1),造成股骨横断骨折(切割时滴注生理盐水，防止损伤骨质)。当切割至股骨直径的2/3时，掰断剩余部分；克氏针(直径1.5 mm, 长度18～22 mm)先顺行插入远端骨髓腔内，再逆行插入近端骨髓腔；观察骨折断端对合良好，且骨折端稳定，即采用生理盐水冲洗，随后逐层缝合。

2.3 分组及给药

34只SD大鼠适应性喂养1周后，随机选取11只作为对照组，仅切除卵巢旁脂肪组织并行右侧股骨骨折合并髓内针固定术；剩余大鼠采用“2.2”项方法进行造模，将造模成功的PMOPF大鼠随机分为模型组、龟鹿二仙胶组和阿仑膦酸钠组，每组6只。根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”进行换算[7],龟鹿二仙胶的灌胃剂量为3.6 g·kg-1,阿仑膦酸钠的灌胃剂量为3.6 g·kg-1,对照组和模型组大鼠给予等剂量生理盐水灌胃，术后第1天开始给药，持续8 周。

2.4 样本制备

末次给药后，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液进行麻醉(10 mL·kg-1),腹主动脉取血，室温静置3 h, 4 500 r·min-1离心10 min, 取上清，冻存于-80 ℃冰箱。游离右侧大腿，小心剔除周围软组织后，保留骨膜，从股骨髁处去除克氏针，4%多聚甲醛溶液固定。

2.5 HE染色、番红固绿染色观察骨折处病理形态

各组随机选取3只大鼠进行检测，取4%多聚甲醛溶液固定的骨组织，自来水流动冲洗30 min, 转移至10% EDTA脱钙液中(pH为7.0～7.2)。待脱钙完成后进行修剪，以骨折处为中点，上下保留5 mm; 梯度酒精脱水，沿股骨长轴进行石蜡包埋、切片(厚度4 μm)。HE染色、番红固绿染色后固封，待干燥后，倒置显微镜下观察骨折处骨痂的病理形态。

2.6 ELISA检测血清BGP、BALP、CTX-1含量

各组随机选取3只大鼠进行检测，取血清样品，室温下静置解冻后，按照各个ELISA试剂盒的说明书进行操作，检测血清中BGP、BALP、CTX-1含量。

2.7 三点弯曲法检测骨折处最大载荷

各组随机选取3只大鼠进行检测，修剪股骨使骨折线到股骨两端的长度一致，将股骨放置于万能材料试验机三点弯曲夹具上，以骨折线为中心，跨度为16 mm, 调整至骨折处为载荷施加部位，股骨接受应力加载时保持两端固定不动，以2 mm·min-1的速率垂直施加载荷直至股骨断裂，并记录最大载荷值。

2.8 RT-qPCR 检测骨折处骨痂BGP mRNA、BALP mRNA、Osterix mRNA表达水平

各组随机选取3只大鼠进行检测，取骨折样本50 mg于液氮中研磨，按照RN54-EASYspinPlus骨组织RNA快速提取试剂盒的说明书进行操作，提取骨痂组织总RNA。检测总RNA浓度及纯度后按照反转录试剂盒操作步骤配制反应体系，于实时荧光定量基因扩增仪中进行逆转录获得cDNA。反应体系(10 μL):TB GREEN 5 μL+Rox DyeⅡ 0.2 μL+DEPC水 2 μL+cDNA 2 μL+正反引物各0.4 μL,扩增条件：95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 40个循环。按照 SYBR Green 法配制反应体系后上机进行qPCR反应。Bio-rad CFX96软件读取Ct值后计算2-△△Ct。以GAPDH作为内参基因，引物序列见表 1。

表1 基因引物序列

2.9 Western Blot检测骨折处骨痂BGP、BALP、Osterix蛋白表达水平

各组随机选取3只大鼠进行检测，取骨折样本50 mg于液氮中研磨，提取总蛋白，使用 BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白含量后，将蛋白样品和Loading Buffer混合致其变性。依据目的蛋白分子量，BALP、Osterix和GAPDH选取10%分离胶，BGP选取15%分离胶，随后进行电泳和转膜；使用快速封闭液室温封闭 15 min, TBST洗膜3次。一抗4 ℃孵育过夜(BGP、BALP、GAPDH的浓度为1：1 000,Osterix的浓度为1：2 000),TBST洗膜3次；二抗室温孵育1 h, TBST洗膜3次。蛋白条带滴加超敏化学发光液，置于凝胶成像仪中拍照，使用 Image J 1.53软件分析蛋白条带的灰度值，并计算各个目的蛋白的相对表达量。

2.10 统计学方法

采用SPSS 26.0软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示。所有数据均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时两两比较采用LSD检验，方差不齐时采用Games-Howell检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3.1 骨质疏松模型鉴定

大鼠切除双侧卵巢12周后，与对照组比较，模型组大鼠BMD降低(P<0.05),说明骨质疏松模型建立成功，见表2。

表2 两组大鼠全股骨BMD比较

3.2 龟鹿二仙胶对PMOPF大鼠骨折处病理形态的影响

HE染色结果显示，对照组大鼠骨折处初步形成未成熟骨组织，构成编织骨，提示骨折进入原始骨痂形成期；模型组大鼠骨折处仅见少量未成熟骨组织；与模型组比较，龟鹿二仙胶组、阿仑膦酸钠组大鼠骨折处骨组织更成熟，含有大量编织骨，见图1。

图1 各组大鼠股骨骨折处HE染色图(×40)   

番红固绿染色结果显示，对照组大鼠骨折处以钙化骨痂为主，仍含有残存软骨组织；模型组大鼠骨折处仍有大量未完成钙化的软骨组织；龟鹿二仙胶组、阿仑膦酸钠组大鼠骨折处含有残存部分软骨组织，已形成较多钙化骨痂。

图2 各组大鼠股骨骨折处番红固绿染色图(×40)   

3.3 龟鹿二仙胶对PMOPF大鼠骨折处最大载荷的影响

与对照组比较，模型组大鼠股骨骨折处最大载荷降低(P<0.01);与模型组比较，龟鹿二仙胶组、阿仑膦酸钠组大鼠股骨骨折处最大载荷升高(P<0.01),见表3。

表3 各组大鼠股骨骨折处最大载荷比较

3.4 龟鹿二仙胶对PMOPF大鼠血清BGP、BALP、CTX-1含量的影响

与对照组比较，模型组大鼠血清BGP、BALP含量减少且CTX-1含量增加(P<0.01);与模型组比较，龟鹿二仙胶组、阿仑膦酸钠组大鼠血清BGP、BALP含量增加且CTX-1含量减少(P<0.05),见表4。

表4 各组大鼠血清BGP、BALP、CTX-1含量比较

3.5 龟鹿二仙胶对PMOPF大鼠骨折处骨痂BGP mRNA、BALP mRNA、Osterix mRNA表达水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠骨折处骨痂BGP mRNA、BALP mRNA、Osterix mRNA表达水平降低(P<0.001);与模型组比较，龟鹿二仙胶组、阿仑膦酸钠组大鼠骨折处骨痂BGP mRNA、BALP mRNA、Osterix mRNA表达水平升高(P<0.05),见表5。

表5 各组大鼠骨折处骨痂BGP、BALP、Osterix基因表达水平比较

3.6 龟鹿二仙胶对PMOPF大鼠骨折处骨痂BGP、BALP、Osterix蛋白表达水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠骨折处骨痂BGP、BALP、Osterix 蛋白表达水平降低(P<0.001);与模型组比较，龟鹿二仙胶组、阿仑膦酸钠组大鼠骨折处骨痂BGP、BALP、Osterix 蛋白表达水平升高(P<0.05),见表6、图3。

图3 各组大鼠骨折处骨痂BGP、BALP、 Osterix蛋白条带图  

表6 各组大鼠骨折处骨痂BGP、BALP、Osterix蛋白表达水平比较

4、讨论

绝经后骨质疏松症属于中医“骨痿”“骨痹”的范畴，肾虚骨枯髓减是绝经后骨质疏松症的根本原因[8]。“肾主骨”理论强调肾精充足则骨髓化生有源，骨强健有力；肾精亏虚则骨髓失养，日久则骨骼脆弱无力，此时轻微外力即会发生骨折即PMOPF,是绝经后骨质疏松症患者的严重并发症，PMOPF本质病因为肾虚髓亏[9]。

廖敏等[10]使用补肾健骨方治疗绝经后骨质疏松症患者，发现该方可明显增加患者腰椎、全髋、股骨颈部位的骨密度，BGP、BALP等骨形成代谢指标明显提高，提示补肾健骨方可以通过调节骨代谢、增加骨密度，改善绝经后骨质疏松症患者的症状。李永贤等[11]使用右归丸对去卵巢大鼠股骨骨折模型进行干预，发现其可增加大鼠骨折处骨痂骨密度，BALP、BGP等成骨细胞标记物明显上调，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRACP)破骨细胞标记物的含量下调，提示右归丸可以通过增强骨形成和抑制骨吸收来促进大鼠绝经后骨质疏松性股骨骨折的愈合。姜益华等[12]使用化瘀补肾方对去卵巢大鼠胫骨骨折模型进行干预，发现其可增加大鼠腰椎和骨折处骨痂骨密度，使骨折处最大载荷增加，从而改善去卵巢大鼠骨折愈合。“肾主骨”理论指导下通过促进骨形成和抑制骨吸收来改善绝经后骨质疏松症的骨代谢情况，亦可通过调节骨代谢平衡来改善PMOPF愈合。

龟鹿二仙胶出自《医方考·虚损劳瘵门》,由鹿角胶、龟板胶、枸杞子和人参组成，鹿角胶、龟板胶联用能峻补阴阳，配伍善于固气的人参和善于滋阴的枸杞子，具有益肝肾、填精髓、强筋壮骨的作用。现代研究表明，龟鹿二仙胶含有的胶原蛋白、氨基酸等成分具有显著的强骨作用，通过介导骨形成和骨吸收的核心基因来增加骨量[13]。前期研究证实龟鹿二仙胶通过促进骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMMSCs)向成骨细胞分化，增加BGP成骨细胞标记物，最终改善去卵巢大鼠腰椎骨密度和骨微结构，增加去卵巢大鼠腰椎及股骨的最大载荷[14]。

本研究发现，切除大鼠双侧卵巢后所诱发的骨质疏松性骨折，原始骨痂形成期的软骨性骨痂生成量多，但向编织骨转换过程较慢，所形成的骨痂在偏光显微镜下折射率明显降低，骨痂中骨基质胶原排列不规则，与去卵巢后雌激素缺乏，成骨细胞数量减少，尤其是骨折部位成骨细胞缺乏，骨基质的生成、分泌和矿化减弱，导致骨折愈合延缓[1]。而在骨痂改造过程中，骨痂表面成骨细胞减少，成骨能力降低，破骨细胞活性旺盛，导致骨组织松散，骨痂质量下降[15]。本实验HE染色和番红固绿染色结果显示，4组均处于原始骨痂形成期，龟鹿二仙胶和阿仑膦酸钠干预后骨折端骨痂虽仍有少量软骨细胞，但桥梁骨痂基本形成，骨折愈合较模型组更成熟，提示龟鹿二仙胶有利于骨折端骨痂的成熟，从而改善PMOPF愈合。

骨生物力学性能是骨强度的最直观体现，而骨“三点弯曲”最大载荷是骨生物力学最主要的评价标准[16,17]。本研究发现，龟鹿二仙胶和阿仑膦酸钠干预8周后，股骨骨折处三点弯曲最大载荷明显高于模型组，表明龟鹿二仙胶可增强去卵巢骨质疏松性大鼠股骨骨折处的最大载荷，改善骨折愈合质量。

成骨细胞的数量和功能与骨质疏松性骨折愈合过程密切相关[18]。成骨细胞由BMMSCs经骨原细胞、前成骨细胞定向分化而来，是成骨的主要功能细胞[19]。BGP由成骨细胞合成分泌，能特异地结合羟磷灰石，进而增加骨盐含量，可反应成骨细胞的活动状态和骨代谢速率[20]。BALP仅由成骨细胞分泌，在调节骨基质矿化、骨基质的黏附以及细胞分裂、迁徙和分化成熟过程中起着重要作用，是判定成骨细胞活动状态和骨形成的重要指标[21]。Osterix在成骨细胞中特异性表达，而在破骨细胞中无表达[22],其在膜内成骨中起着重要作用，是成骨细胞分化和矿化的重要转录因子[23]。徐卫峰等[24,25]研究显示，龟鹿二仙胶通过改善骨形成和骨吸收的不平衡来逆转因雌激素缺乏导致的骨代谢改变。本研究发现，龟鹿二仙胶和阿仑膦酸钠干预后大鼠骨折处骨痂BGP、BALP、Osterix的基因和蛋白相对表达水平均显著升高，大鼠血清中BGP、BALP含量明显上升，提示龟鹿二仙胶可通过调节骨形成，从而促进去卵巢大鼠股骨骨折的愈合。

绝经后骨质疏松症因雌激素的骤降，导致骨吸收异常增强[26]。骨折发生后，较高水平的骨吸收将严重影响骨折愈合，此时抑制骨吸收非常重要[27]。CTX-1是骨降解后的I型胶原片断，能精确反映骨吸收速率，在监测骨吸收方面有很强的特异性和灵敏性[28],被国际骨质疏松症基金会(IOF)和国际临床化学与检验医学联合会(IFCC)推荐为骨吸收的参考标记物，可反映破骨细胞的活跃状态[29]。王科艇等[30]使用龟鹿二仙胶治疗原发性骨质疏松症患者，发现其可有效促进骨形成，提高骨密度，改善患者疼痛程度。本实验中，龟鹿二仙胶和阿仑膦酸钠的干预使去卵巢骨质疏松性骨折大鼠血清中 CTX-1 的含量明显降低，提示龟鹿二仙胶可以有效抑制骨吸收，从而改善去卵巢骨质疏松性股骨骨折的愈合。

综上所述，龟鹿二仙胶可以促进PMOPF大鼠股骨骨折处软骨细胞向编织骨转化，增加骨折处的最大载荷，从而改善骨质疏松性骨折的愈合质量，其机制与增强成骨，促进骨基质的形成和分泌，抑制骨吸收有关。本研究为PMOPF的临床诊疗提供基础依据与新思路。

参考文献:

[3]莫健,黄冲,李晨静,等.骨质疏松性骨折分级预防现状[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2022,15(4):403-411.

[4]牛素生,林建华,李楠,等.龟鹿二仙胶对去卵巢骨质疏松大鼠腰椎骨强度的影响及机制[J].福建中医药大学学报,2014,24(3):5-7.

[5]牛素生,李楠,张燕,等.龟鹿二仙胶诱导大鼠骨髓基质干细胞成骨分化作用及对Wnt通路的影响[J].中国中西医结合杂志,2017,37(1):72-78.

[6]牛素生,杜梦凡,刘俊宁,等.中医正骨理论指导下大鼠股骨干骨折髓内固定模型的实验研究[J].福建中医药,2023,54(8):31-34.

[7]黄继汉,黄晓晖,陈志扬,等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J].中国临床药理学与治疗学,2004,9(9):1069-1072.

[8]王璠琛,何琪,肖嘉聪,等.“肾主骨” 理论“髓变先于骨变” 的肾-髓-骨调节机制构建[J].中国骨质疏松杂志,2023,29(9):1354-1361.

[9]卢爱民,尹君,李春峰,等.基于“肾主骨生髓” 理论观察补肾活血汤对绝经后骨质疏松症β-catenin蛋白表达影响及相关性分析[J].中医药临床杂志,2023,35(9):1778-1783.

[10]廖敏,谭洁,吉滔,等.补肾健骨汤对绝经后骨质疏松症患者骨代谢指标及性激素水平影响研究[J].陕西中医,2023,44(6):726-729.

[11]李永贤,张顺聪,梁德,等.补肾中药通过调控Notch1蛋白的表达治疗大鼠骨质疏松性骨折的作用研究[J].中国骨质疏松杂志,2017,23(11):1425-1430.

[12]姜益华,徐金渭,熊振飞,等.补肾健骨汤对绝经后骨质疏松性胸腰椎压缩性骨折患者术后疗效的影响[J].中国实用妇科与产科杂志,2022,38(9):950-954.

[13]刘朋,杨鸫祥,于冬冬,等.基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症的作用机制[J].海南医学院学报,2022,28(3):216-224.

[14]牛素生,林建华,李楠,等.龟鹿二仙胶对去卵巢大鼠骨显微结构的影响[J].中华中医药杂志,2015,30(3):887-889.

基金资助:福建省卫生健康委员会中青年骨干项目(2019-ZQN-73);福建中医药大学中医骨伤学科开放课题项目(XGS2022001);

文章来源:杜梦凡,张燕,刘俊宁,等.龟鹿二仙胶对绝经后骨质疏松性骨折愈合的影响[J].中医学报,2024,39(05):1053-1060.