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骨髓间充质干细胞缓解模拟微重力对小鼠大脑皮质的不利影响

2024-05-30 45 上传者：管理员

摘要：目的探究骨髓间充质干细胞(BMSCs)对微重力环境下大脑的保护和分子调节机制。方法以后肢去负荷(HU)模型模拟失重生理效应，将小鼠分为：对照组，HU模型组、BMSCs治疗组，每组6只，对比分析模拟微重力对小鼠大脑造成的损伤及BMSCs对损伤的修复作用；利用RT-qPCR检测大脑皮质中关键促炎因子Il-6、Il-1β和Tnf-α的表达水平；利用免疫组织化学染色检测大脑皮质中小胶质细胞(IBA1阳性)和星形胶质细胞(GFAP阳性)的比例；利用Western blot检测细胞凋亡与衰老相关蛋白BAX、BCL-2、p21、p53的表达水平。结果与野生小鼠相比，后肢去负荷小鼠大脑皮质的Il-6、Il-1β和Tnf-α的表达水平显著上升(P<0.05),BAX、p21和p53蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),BCL-2蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),小胶质细胞(IBA1阳性)和星形胶质细胞(GFAP阳性)的比例升高(P<0.05);经过BMSCs治疗以后，HU小鼠大脑皮质的Il-1β的表达水平显著降低(P<0.05),BAX、p21和p53蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),BCL-2蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),小胶质细胞(IBA1阳性)和星形胶质细胞(GFAP阳性)的比例减少(P<0.05)。结论 BMSCs通过抑制炎性反应、抗细胞凋亡与衰老来缓解模拟失重对小鼠大脑产生的不利影响。

关键词：
凋亡
后肢去负荷
微重力
细胞衰老
间充质干细胞(MSCs)
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在长时间的太空任务执行期间，持续暴露于微重力环境可使人体产生失重生理效应[1,2]。据已有文献报道，长期处于失重状态会使宇航员面临一系列健康风险，如共济失调、姿态失衡、知觉错觉、身体疲劳以及认知功能障碍等[3]。太空飞行任务作为国家科技战略计划，既重要又充满挑战。确保宇航员在任务执行中的健康安全和认知能力，是完成航行任务的关键。因此，及时辨认和应对微重力在细胞与分子水平上可能对大脑产成的负面效应，预防由此引发的精神疲倦和思维障碍，对太空任务的成功具有极其重要的意义。

对啮齿动物进行后肢去负荷(hindlimb unload-ing, HU)是一种在陆地上模拟宇航环境下失重生理效应的有效手段，常被用来探索长期太空飞行产生的影响[4]。HU是将动物的尾巴悬吊起来，仅使其前肢着地，以减少后肢的机械负荷，在此期间体液可重新分布到头部。有证据表明，该模型可导致神经元突触传递和可塑性减弱，进而导致大脑海马和皮质的神经递质水平失衡、神经元形态变化、突触结构重塑，以及细胞中氧化应激水平增加，这可直接引起大脑相关的行为学活动异常[1]。然而，大脑中其他细胞群体在HU后产生的功能性相关变化报道相对较少。例如，研究大脑常驻免疫细胞-小胶质细胞在HU模型中的变化，对于理解微重力对大脑免疫平衡乃至全身系统的影响具有重要的意义。在探索治疗微重力对大脑损伤的策略时，同样关注除神经元以外的其他脑细胞群体，可全面理解和应对太空飞行风险这一复杂问题。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)来源广泛，存在于人体发生、发育过程的许多种组织中，且易从成体中分离培养，是目前再生医学领域研究最广泛的干细胞。一方面，MSCs具有不断自我更新和分化为多谱系细胞的潜能，可用于组织再生；另一方面，MSCs具有双向免疫调节作用，既可以通过分泌促炎因子来激活免疫应答，又可以促进抑炎因子的生成，改善组织损伤处微环境，进一步推进组织修复过程[5]。因此， MSCs在修复大脑损伤方面具有巨大的潜力。本研究采用小鼠骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow-derived MSCs, BMSCs)来探究其对HU小鼠模型大脑的保护作用，为预防和减轻微重力引起的大脑损伤提供新的研究思路和理论依据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：

用于提取BMSCs的小鼠为SPF级4周龄C57BL/6小鼠，体质量约20 g, 允许其在笼内自由活动、摄食和饮水。饲养室温度 24 ℃,采用 12 h /12 h 明暗交替光照。HU小鼠及对照组小鼠由中国航天员科研训练中心李英贤课题组提供。尾吊结束后，小鼠随机分为后肢去负荷组(HU)和干细胞治疗组(BMSCs),对照组为未经过尾吊的同品种、同周龄的野生小鼠，每组6只[维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2021-0011]。本实验经过中国航天员科研训练中心伦理委员会批注(伦理批号：ACC-IACUC-2022-031)。

1.1.2 主要试剂：

DMEM/F12 (1:1)培养液、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素(Gibco公司);透明质酸酶(Sigma公司);Trizol试剂、BCA蛋白定量试剂盒(碧云天公司);Triton X-100(Amresco公司);RNA提取、cDNA合成和RT-qPCR相关试剂(TaKaRa公司);p21、p53、BAX、BCL-2、GFAP、β-actin、GAPDH抗体，山羊抗兔或山羊抗鼠HRP结合二抗和荧光二抗(Proteintech公司);IBA1抗体(武汉ABclonal生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分离培养：

以颈椎脱臼法处死小鼠，用75%乙醇浸泡消毒，在无菌状态下取出双侧股骨和胫骨，浸泡于无菌含青霉素-链霉素的PBS溶液中。剔除股骨和胫骨周围的肌肉、结缔组织，用含青霉素-链霉素的PBS溶液清洗3遍。用注射器以完全培养基(DMEM/F12 培养液+10% FBS+1%青霉素-链霉素)反复冲洗骨髓腔直至骨头变白。收集骨髓液，离心后加入适量完全培养基接种于6孔培养板中，置于37 ℃、5% CO2和饱和湿度的细胞培养箱中培养。24～48 h后去除悬浮液，接下来每3天更换培养基1次，传至第3代，收集细胞用于小鼠鼻腔注射。

1.2.2 HU小鼠干细胞治疗：

HU组和BMSCs治疗组小鼠使用6周的尾部悬吊来模拟微重力环境下的失重状态。在尾吊1周和2周时，取下小鼠进行鼻腔注射给药，其中HU组小鼠注射同等体积的PBS。用1.5%三溴乙醇麻醉小鼠，对小鼠的每个鼻孔进行透明质酸酶(溶于PBS, 100 U/只，共6 μL)处理，增加鼻腔黏膜通透性。30 min后，向小鼠的鼻孔注射BMSCs或PBS,每个鼻孔分2次注射，每次注射3 μL,总共12 μL(含106细胞)。注射时，将玻璃注射器的针头(平头、金属质)伸入小鼠鼻中距鼻孔约2 mm的位置，缓慢注入相应试剂后，令小鼠处于直立仰头状态30 s, 使其将试剂自然嗅入。小鼠清醒后，继续尾吊至实验结束。

1.2.3 脑组织取材和样品制备：

尾吊结束后，用1.5%三溴乙醇麻醉小鼠，每组随机选取3只分离大脑皮质组织(具体位置为梨状皮质),置于液氮保存，用于后续mRNA以及蛋白检测。每组余下3只分离整个大脑，用4%多聚甲醛固定，依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(10 μm)、烘片，室温保存，用于免疫组织化学染色。

1.2.4 RT-qPCR检测代表性促炎因子的表达水平：

使用Trizol试剂提取小鼠大脑皮质样品的总RNA,随后检测其浓度和纯度，用于反转录反应，进行cDNA合成。以cDNA为模板进行RT-qPCR荧光定量，采用2-△△Ct法计算绝对mRNA水平。同时，选用β-actin和Gapdh作为内参基因计算目标基因的相对mRNA水平。Il-6的引物上游序列为：5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC;下游序列为：5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC。Il-1β的引物上游序列为：5′-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG;下游序列为：5′-TGGATGCTCTCATCAGGACAG。Tnf-α的引物上游序列为：5′-CAGGCGGTGCCTATGTCTC;下游序列为：5′-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG。β-actin的引物上游序列为：5′-GTGACGTTGACATCCGTAA AGA;下游序列为：5′-GCCGGACTCATCGTACTCC;Gapdh的引物上游序列为：5′-AGGTCGGTGTGAA CGGATTTG;下游序列为：5′-GGGGTCGTTGATGGC AACA。

1.2.5 Western blot检测细胞凋亡及衰老相关蛋白的表达水平：

用RIPA裂解液提取小鼠大脑皮质组织的总蛋白，并用BCA法定量蛋白浓度。进行常规SDS-PAGE电泳后，将蛋白转至PVDF膜。使用5% BSA在室温下对膜封闭1 h。加入相应的一抗p21、p53、BAX、BCL-2(1∶1 000), β-actin、GAPDH(1∶10 000),4 ℃过夜孵育。用TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。加入相应的HRP二抗(1∶10 000),室温孵育1 h后再洗膜3次。使用化学发光法对PVDF膜进行显影，利用Image J 对目的条带进行定量分析。

1.2.6 免疫组织化学染色检测小胶质细胞和星形胶质细胞的分布与比例：

石蜡组织切片经过脱蜡、透化、抗原修复、封闭后，加入一抗GFAP(1∶500)或IBA1(1∶500),4 ℃ 孵育过夜。用PBS缓冲液洗去一抗后，加入荧光二抗(1∶10 000),室温孵育2 h。二抗孵育结束后，用PBS洗涤3次。随后用DAPI稀释液孵育10 min。用抗荧光淬灭剂封片，在共聚焦荧光显微镜上观察拍照。通过计算IBA1或GFAP阳性细胞个数与DAPI标记细胞个数的比值得出细胞比例。

1.3 统计学分析

实验数据均用平均值±标准差表示，并使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。样本数量n为每组3只小鼠，多组间差异显著性用单因素方差(ANOVA)与Tukey′s post-hoc检验进行分析。

2、结果

2.1 BMSCs治疗可降低HU小鼠大脑皮质中的炎性因子表达水平

与对照组小鼠相比，HU组小鼠大脑皮质中促炎因子Il-6、Il-1β和Tnf-α的表达水平均显著升高(P<0.05)(图1)。在接受BMSCs治疗后，Il-1β的表达水平得到了显著的降低(P<0.05)(图1),Il-6和Tnf-α的表达水平也有降低趋势，尽管未达到统计学显著性差异。

2.2 BMSCs治疗可降低HU小鼠大脑皮质中小胶质细胞和星形胶质细胞的比例

与对照组相比，HU组小鼠大脑皮质中IBA1阳性小胶质细胞和GFAP阳性星形胶质细胞的数量显著增加(P<0.05)(图2,3);而相较于HU组，BMSCs组小鼠大脑皮质中IBA1阳性细胞和GFAP阳性细胞数量显著降低(P<0.05)(图2,3)。

2.3 BMSCs治疗可降低HU小鼠大脑皮质中细胞凋亡的水平

与对照组相比，HU组小鼠大脑皮质促凋亡蛋白BAX的表达水平显著升高(P<0.05),抗凋亡蛋白BCL-2的表达水平显著降低(P<0.05),BAX/BCL-2比值显著上升(P<0.05);与HU组相比，BMSCs组大脑皮质BAX的表达水平显著降低(P<0.05),BCL-2表达水平显著上升(P<0.05),BAX/BCL-2比值显著降低(P<0.05)(图4)。

2.4 BMSCs治疗有效改善HU小鼠大脑皮质中的细胞衰老状况

与对照组相比，HU组小鼠大脑皮质细胞衰老标志蛋白p21、p53的表达水平显著升高(P<0.05);与HU组相比，BMSCs组小鼠大脑皮质p21、p53的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)(图5)。

3、讨论

长期处于微重力环境中的个体存在学习与记忆能力减弱的风险。关于这一损伤的机制与有效预防手段，目前尚未有明确的定论[6]。MSCs具有损伤趋向性，植入体内后能可快速迁移至损伤部位，分化为神经元样细胞[7,8,9]。此外，MSCs能够分泌多种生长因子和抗炎因子，用于调节免疫微环境，降低神经元凋亡水平，为治疗神经系统相关疾病提供了新思路。

图1 小鼠大脑皮质中促炎因子Il-6, Il-1β 和Tnf-α的表达

图2 BMSCs对HU小鼠大脑皮质星形胶质细胞的影响

图3 BMSCs对HU小鼠大脑皮质小胶质细胞的影响

图4 不同组小鼠大脑皮质中BAX与BCL-2的代表性蛋白质印迹图及其定量分析

图5 不同组小鼠大脑皮质中p53与p21的代表性蛋白质印迹图及其定量分析

本研究显示，HU处理后，小鼠大脑皮质中促炎因子(Il-6、Il-1β和Tnf-α)的表达水平显著升高，而经过BMSCs治疗后其表达水平下调，说明BMSCs能够在一定程度上逆转由HU引起的大脑炎性反应。过度激活的小胶质细胞可吞噬正常神经元，引起神经元的损失[10,11]。具有神经毒性的星形胶质细胞既可分泌促炎因子，又可被小胶质细胞激活，进一步引发神经元凋亡[12]。HU处理后，小鼠大脑皮质中小胶质细胞和星形胶质的数量均显著上升，而BMSCs可显著降低这两种细胞的数量，并抑制促炎因子的表达，表明BMSCs可通过调控小胶质细胞和星形胶质细胞的比例来抑制炎性反应，保护处于炎性状态的神经元。

过度的炎性反应会导致细胞凋亡。HU处理后，小鼠大脑皮质中促凋亡蛋白BAX的表达上调，抑凋亡蛋白BCL-2的表达下调。而经过BMSCs治疗后，BAX和BCL-2的表达改变以及代表细胞凋亡阈值的BCL-2/BAX比值均得以逆转，这体现了BMSCs的抗凋亡作用。此外，衰老细胞可通过释放衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)因子改变组织微环境，进而引发过度炎性和损伤[13]。本研究中的Il-6、Il-1β和Tnf-α均为SASP的一部分，与细胞衰老引起的炎性反应密切相关[14]。HU小鼠经过BMSCs治疗后，其大脑皮质中的衰老驱动因子p21和p53的表达显著下调，说明因HU引起的衰老表型得到了有效改善。

综上所述，BMSCs可通过抑炎、抗凋亡、抗衰老等多重机制来有效逆转HU对大脑产生的不良效应。值得一提的是，本研究采用的干细胞鼻腔注射方式成功绕过了血脑屏障，验证了一种非侵入性的给药途径，对神经系统疾病药物的高效递送方案具有借鉴意义。这一研究不仅为预防和治疗太空微重力对人体的潜在损伤提供了新方法，也为相关治疗机制提供了理论依据。

参考文献:

[4]王婷梅,张永亮,王艳丽,等.尾吊对大鼠海马组织学习记忆及凋亡相关蛋白表达的影响[J].航天医学与医学工程,2016,29:235-239.

[6]李家卉,李方方,张敏,等.海马神经元退行性变参与模拟失重所致大鼠认知损伤[J].航天医学与医学工程,2021,34:122-127.

基金资助:中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2022-I2M-1-012);全国重点实验室专项经费(2060204);国家重点研发计划(2020YFA0113000);高等学校学科创新引智计划(B18007);

文章来源:龚金涛,厉建伟,李玉恒,等.骨髓间充质干细胞缓解模拟微重力对小鼠大脑皮质的不利影响[J].基础医学与临床,2024,44(06):772-778.