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关于产几丁质脱乙酰酶菌株MCDAⅡ-2粗酶酶学性质的研究
摘要：从连云港高公岛海域采集的海泥中使用平板变色圈法初筛和摇瓶发酵复筛后,获得一株产几丁质脱乙酰酶的菌株MCDAⅡ-2。综合形态学特征以及16SrDNA序列分析最终将菌株MCDAⅡ-2鉴定为Rhodococcushoagii。进而研究其酶学性质,得该几丁质脱乙酰酶最适催化温度为35℃,最适pH为8.0。Na+、Mg2+、Li+、Sr2+对酶促反应起到促进作用,Ca2+、Ba2+、Co2+、Cd2+、Fe2+及EDTA对酶促反应起到了抑制作用,而K+对酶促反应影响较小。酶在25℃～35℃时较稳定,在中性和弱碱性条件下稳定性较好。本次研究的结果将为几丁质脱乙酰酶的工业化应用奠定基础。
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几丁质在自然界中含量丰富，但因其化学结构稳定，溶解性差，导致应用受限。几丁质酶是一种可以催化几丁质产生N-乙酰氨基葡萄糖单体或者低分子量几丁寡糖的水解酶，几丁质脱乙酰酶就是其中一种。[1]壳聚糖是由几丁质经处理脱乙酰基后所得产物[2,3,4]。它因分子内含有大量游离的氨基和碱性阳离子，所以较几丁质而言具有更好的溶解性和生物可降解性，这类天然高分子由于其多种优良的性能，被各行各业所关注且广泛应用于众多领域[5,6]。以几丁质为原料制备壳聚糖的方法分为两种，一种是化学法，另一种为生物法。当前，化学法是最主要的工业使用方法。但化学法需要使用大量浓碱处理，反应时间长，生产成本高，生产过程能耗大，而且由于脱乙酰度不易被控制会导致产品质量不稳定，几丁质的分子链遭到破坏，更重要的是排放物会对环境造成严重污染。同化学法相比，生物法反应条件温和，脱乙酰度一致，所得产品品质稳定，且过程绿色环保[7]。
目前报道的CDA产生菌主要为真菌，包括Rhizopus circinans[8]、Saccharomyces cerevisiae[9]、Colletotrichum lindemuthianum[10]、Absidia coerulea[11]等。但与真菌相比，细菌所需培养时间更短，产酶的速度更快，因此在生物法中产几丁质脱乙酰酶细菌是比真菌更好的选择。但是，目前产CDA细菌报道较少，只有Rhodococcus qingshengii[5]、C.aminovalericum、Bertholletiae等。海洋环境是一种独特环境，因此许多海洋微生物可分泌有新颖的催化特性的酶。本研究是从海泥样品中筛选产CDA细菌的菌株，研究其粗酶酶学性质，为几丁质生产壳聚糖提供新颖、可靠的酶源。
1、材料与方法
1.1材料与仪器
海泥样品：海泥样品取自于高公岛码头。
富集培养基：几丁质2.5g/L、K2HPO40.7g/L、KH2PO40.3g/L、MgSO40.5g/L，陈海水配置，pH7.0；平板筛选培养基：几丁质2g/L、K2HPO40.7g/L、KH2PO40.3g/L、MgSO40.5g/L、对硝基乙酰苯胺0.2g/L、琼脂20g/L，陈海水配置，pH7.0；发酵培养基：蛋白胨5g/L、（NH4)2SO43g/L、KH2PO41.5g/L、MgSO40.5g/L、粉末几丁质20g/L，陈海水配置，pH7.0。
仪器：SW-CJ-1D超净工作台：苏州净化设备有限公司；分光光度计：杭州明基科学仪器有限公司；SPX-250B-2生化培养箱：上海博迅实业有限公司；DK-8D电热恒温水槽：上海一恒科技有限公司；Nikon90i全电动显微镜：上海普赫光电科技有限公司。
1.2实验方法
1.2.1产几丁质脱乙酰酶海洋细菌的筛选
初筛：称取1g泥样，加入富集培养基，在30℃、180r/min培养72h。取富集培养液100μL均匀涂布于筛选培养基，30℃、培养3d～5d，挑取周围出现明显黄色圈的菌落，在LB培养基中进一步划线纯化并保存。
复筛：挑取初筛得到的单菌落接到种子液中，30℃、180r/min摇床培养24h，再以1%的接种量将种子液接种至发酵培养基中，30℃、180r/min摇床培养72h，取上清为粗酶液并进行酶活力测定和催化α-几丁质脱乙酰的测定。选取酶活力较高，并能催化几丁质脱乙酰的菌株进行进一步研究其酶学性质。
酶活性和催化α-几丁质脱乙酰的测定按照报道的方法进行[12]。酶活单位（U）定义：在上述反应条件下每小时产生对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶活力单位。
1.2.2菌株MCDAⅡ-2的鉴定
肉眼观察菌株在筛选培养基上的菌落形状、颜色等形态；在光学显微镜下观察菌体的形态特征；革兰氏染色等指标测定参照文献[13]方法进行。
用Axygen试剂盒提取MCDAⅡ-2的基因组DNA作为PCR扩增模板，16SrDNA通用引物采用27F:5’–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，反应体系为：PCRmix(12.5μL），上下游引物（各1μL),DNA模板（2μL），水（9.5μL）。反应程序：94℃变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸90s,32个循环；72℃终延伸10min。PCR产物送至南京思普金公司测序。序列测定后，提交GenBank数据库并进行BLAST比较分析，利用MEGA7软件进行同源性分析，构建系统发育树。
1.2.3pH对酶活性和稳定性的影响
配制柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和甘氨酸缓冲液，将其pH分别调至柠檬酸钠缓冲液pH5.0、pH6.0，柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液pH6.0、pH7.0、pH8.0，甘氨酸缓冲液pH8.0、pH9.0，并向其中加入酶液和底物，缓冲液、酶液和底物体积比为3∶1∶1，放入30℃水浴锅保育，分别测定其酶活[14]。将酶活最高的一组酶活设定为100%，其余各组则据此计算相对酶活，进而确定酶的最适pH。向配置好的缓冲液中加入酶液和底物，在30℃水浴锅恒温反应20h后测定酶活，研究其pH稳定性。每组设置3个重复实验，采用Origin2018作图。
1.2.4温度对酶活性和稳定性的影响
分别设置25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃为反应温度，测定在不同温度下该菌株的酶活力。所得数据将最高的一组设定为100%，剩余各组则计算相对酶活，从而确定酶的最适温度。将酶液在不同温度下分别保温2h、4h、6h、8h、10h后，测定其酶活力，研究其温度稳定性。每组设置3个重复实验，采用Origin2018作图。
1.2.5金属离子对酶活力的影响
向粗酶液中添加底物（200mol/L的对硝基乙酰苯胺水溶液）1mL，以及K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Li+、Ba2+、Sr2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、EDTA，调整离子浓度分别为0.1mmol/L、0.2mmol/L，分别测定酶活[15]。以加入蒸馏水，不加含金属离子溶液的组为对照组，对照组相对酶活即为100%，其余组根据对照组计算相对酶活，研究金属离子对酶活力的影响。每组设置3个重复实验，采用Origin2018作图。
2、结果与分析
2.1几丁质脱乙酰酶产生菌的筛选
本次实验通过变色圈法总共筛选得到了5株拥有变色圈的菌株，将这些菌株进行划线分离纯化，保存于斜面培养基中，置于4℃冰箱保存。将初筛得到的菌株接入种子培养液中，30℃摇床培养24h后，以1%的接种量接入发酵培养基，30℃培养72h，分别测定其酶活力。选取酶活力最高的作为实验菌株，即为MCDAⅡ-2。
图1平板变色圈
表1产几丁质脱乙酰酶菌株的活性
2.2菌株MCDAⅡ-2的鉴定
光学显微镜观察确定菌株MCDAⅡ-2为革兰氏阳性双球菌（图2a），无芽孢。在LB固体培养基上培养48h后：菌落呈橘红色、不透明、表面光滑湿润、稍有突起，是规则的圆形、易挑取（图2b）。使用MCDAⅡ-2菌株的基因组DNA作为模板扩增16SrDNA序列，将PCR产物纯化测序后，所得到的序列进行Blast比对，发现菌株MCDAⅡ-2与Rhodococcushoagii的同源性最高，相似度达到了100%。利用MEGA7.0软件通过邻接法构建系统发育树（图3），菌株MCDAⅡ-2与Rhodococcushoagii在同一分支，进一步表明二者亲缘关系最近。证明菌株MCDAⅡ-2为霍氏红球菌，而在目前可查文献中，还没有找到关于海洋霍氏红球菌产几丁质脱乙酰酶的相关报道。
图2菌株MCDAⅡ-2的形态学特征
图3基于菌株MCDAⅡ-216SrDNA及其同源序列构建的系统发育树
2.3酶学性质的研究
2.3.1pH对酶活性的影响
通过使用不同pH的缓冲溶液，让底物和酶液在不同酸碱环境下反应后测定其酶活力。这个做法将引起酶分子中活性部位的结构发生改变，而导致这个改变的原因则是由于酶的构象可以因pH的不同而发生改变。因此，在过酸或者过碱的情况下，酶活力都将快速丧失。酶活力结果（图4）表明，该酶在pH6.0～pH9.0时均有较高的酶活力，而当pH8.0时，酶活力最高[16]。但是酶最适pH的确定所受影响并不是单一的，而是受到众多因素的影响，比如当所选底物、缓冲液的种类和浓度出现变化时，酶的最适pH也会随之发生改变，因而酶最适pH只在一个特定条件下才有意义。
2.3.2温度对酶活性的影响
分别在已选定的七个不同温度下测定酶活力的大小，结果表明（图5),35℃时，酶活力最高。当温度高于35℃时，随着温度升高，酶活力快速下降。由结果可知，酶促反应与温度的相互关系主要为两方面：一方面，温度的升高使酶促反应的反应速率加快；另一方面，酶蛋白由于温度的升高使得逐渐变性失去活性，从而引起反应速率下降。酶最适温度的确定就是由这两种影响综合产生。
图4pH对酶活力的影响
图5温度对酶活力的影响
2.3.3金属离子的影响
将不同浓度的金属离子加入粗酶液中，反应结束后的测定结果表明（图6)Na+、Mg2+、Li+、Sr2+对酶活有激活作用。Ca2+、Ba2+、Co2+、Cd2+、Fe2+及EDTA则具有抑制作用。而K+对酶活的激活作用微弱。这个结果与其它文献报道中Cu2+、Co2+、Fe2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+对CDA有促进作用，而Mo2+、Zn2+、Pb2+、Ba2+、EDTA对CDA具有抑制作用不同[14]。说明不同来源的CDA受到金属离子对其的影响有差别。
图6金属离子对酶活力的影响
2.3.4pH对酶稳定性的影响
菌株MCDAⅡ-2的酶液和底物分别加入不同pH的缓冲液中，保存于30℃水浴锅中，在20h后测得吸光度，计算相对酶活并绘制相对酶活曲线（图7），图7表明，该酶在pH7.0～pH9.0范围内有较好的催化活力，保温20h后酶活力仍能保持80%以上。
图7pH稳定性
2.3.5温度对酶稳定性的影响
将菌株MCDAⅡ-2的酶液放置在6个不同温度的水浴锅里保存，每隔2h测定其酶活力，将所得吸光度值最高的一组设为100%，其余各组计算其相对酶活力，并绘制相对酶活曲线（图8）。如图表明，菌株MCDAⅡ-2在35℃时酶活力较为稳定，水浴锅保温10h后酶活仍可保持在80%以上；但在45℃水浴锅保温10h后酶活降至20%以下。
图8温度稳定性
3、结论
本研究从高公岛海泥中筛选出一株产几丁质脱乙酰酶的菌株MCDAⅡ-2，通过菌落、菌体形态特征观察和16SrDNA序列分析、鉴定，将该菌株确定为霍氏红球菌。该酶的最适反应温度为35℃。在35℃保存10h后酶活仍达到80%以上。该酶最适pH8.0。在pH8.0的甘氨酸缓冲液中保存20h后仍能保持90%的相对酶活。Na+、Mg2+、Li+、Sr2+对酶活力起到激活作用，Ca2+、Ba2+、Co2+、Cd2+、Fe2+及EDTA对酶活力起到了抑制作用，K+对酶活力的促进作用微弱。
参考文献：
[1]胡荣康,肖正,林满红,等.微生物热稳定几丁质酶的研究进展[J].食品工业科技,2016,37(22):359-364.
[2]杨倩,刘建辉,蒋彤,等.几丁质脱乙酰酶的研究进展[J].食品研究与开发,2017,38(10):200-203.
[5]张菁菁,董文宾,缑敬轩.几丁质脱乙酰酶菌株的筛选鉴定及酶学性质[J].食品工业科技,2012,33(6):244-246,249.
[12]刘丽,赵祥颖,刘建军.几丁质脱乙酰酶产生菌的筛选[J].中国酿造,2011,30(6):61-64.
[13]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社,2001:22-28.
[14]张永勤,许文廷,邢明霞,等.表面脱乙酰化甲壳素颗粒固定溶菌酶及酶学性质研究[J].食品工业科技,2019,40(5):188-192,200.
[15]鲁晶娣.Bacillusnakamurai壳聚糖酶的酶学性质及其活性位点研究[D].广西科技大学,2019.
[16]韩丽,李磊,曾毅,等.一株产酯酶窖泥细菌的筛选、鉴定及酶学性质研究[J].中国酿造,2019,38(6):43-48.
王敏卜,柴金龙,武波飞,苏永成,王淑军,焦豫良,杨杰,房耀维,刘姝.一株产几丁质脱乙酰酶海洋细菌的Rhodococcushoagii筛选､鉴定及酶学性质[J].中国食品添加剂,2020,31(05):63-68.
基金:国家自然科学基金项目(31772016);江苏省海洋科技创新专项(HY2018-10);江苏省“六大人才高峰”第十二批高层次人才项目(SWYY-195);江苏省“333高层次人才培养工程”;连云港市“521高层次人才培养工程”.
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期刊名称：海洋学研究
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主管单位：国家海洋局
主办单位：中国海洋学会,国家海洋局第二海洋研究所,浙江省海洋学会
出版地方：浙江
专业分类：科学
国际刊号：1001-909X
国内刊号：33-1330/P
创刊时间：1983年
发行周期：季刊
期刊开本：16开
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2020-07-03
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