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关于篮状菌次级代谢活性化合物的探究
摘要：本文报道了一株分离自南极海泥,通过5.8SrDNA序列鉴定为篮状菌属的真菌,其发酵粗提物能够有效抑制MRSA和MRSE的生长,但是其发酵能力不稳定。通过优化发酵条件,首次发现提出一株篮状菌属真菌在白光照射下,以大米为营养源,28℃培养,能够稳定发酵出黄色活性化合物。后续经大孔吸附树脂、ODS层析柱,SephadexLH-20凝胶和HPLC分析得到黄色化合物,通过1H-NMR和13C-NMR确定其结构,为聚酮化合物Rugulosin。
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真菌次级代谢产物主要有聚酮类、生物碱类、萜类、肽类和其他类化合物[1]，在不同的发酵策略下可能会发酵不同的次级代谢产物。本研究首次报道通过白光光照一株篮状菌，可以稳定发酵出一种聚酮化合物Rugulosin，为进一步研究其次级代谢产物生物学活性以及合成通路提供化合物基础。
1、材料与方法
1.1菌株
真菌SP14由中国药科大学海洋药学教研室保存。
1.2培养基
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：将马铃薯淀粉1g,葡萄糖4g溶于200ml水中，121℃灭菌20min。浅层大米固体培养基：50ml玻璃锥形瓶中加入10g大米和10ml水，121℃灭菌20min。
1.3分子学鉴定
以真菌SP14基因组DNA为模板，使用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增5.8SrDNA序列。PCR使用50ul反应体系，反应条件为95℃预变性3min,95℃变性15s,56℃退火15s,72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物使用2%凝胶电泳验证纯化，回收测序。将测序结果进行Blast比对，使用Mega-X软件，采用邻接法（Neighbor-Joining,NJ）构建系统发育树。
1.4发酵条件优化
挑取活化的真菌SP14接种到含200mlPDA的500ml锥形瓶中，28℃，200rpm震荡培养4天得种子液，吸取2ml种子液接种在浅层大米固体培养基上，设置光照组与避光组。光照组：每组3个平行培养瓶。避光组：每组3个平行培养瓶，使用避光锡箔纸包裹。将两组培养瓶置于28℃恒温光照培养箱中，每24小时观察取样，HPLC检测，第三天至至七天每天取样，第7天至第17天间隔取样。光照培养箱的光照功率为48w。HPLC分析条件为：流速为1ml/min，流动相乙腈和水分别添加0.1%甲酸。梯度洗脱程序为：0-5min,5%乙腈；5-25min,5-100%乙腈；25-26min,100-5%乙腈；26-30min,5%乙腈（下同）。
1.5活性产物分离纯化
将真菌SP14种子液接种在1kg浅层大米固体培养基上，28℃。光照培养20天。发酵结束后，使用乙醇超声提取3次，合并减压浓缩得到粗提物浸膏。粗提浸膏经过大孔吸附树脂柱层析粗分，依次用纯水，20%,40%,60%,80%,100%乙醇水梯度洗脱，HPLC检测其主要富集在60%组分（1.036g）；将60%组分减压浓缩后使用ODS层析柱分离，依次用20%,40%,60%,80%,100%甲醇水梯度洗脱，HPLC检测其主要在80%-2组分（47.8mg）；将上述组分减压浓缩后使用SephadexLH-20凝胶分离，流动相为甲醇，用试管分管收集后使用HPLC检测纯度后合并减压浓缩得黄色化合物(17.6mg)。
2、结果与分析
2.1真菌种属鉴定
PCR产物条带单一，经测序，其分子量大小为580bp。将序列上传至NCBI数据库进行Blast比对，选取同源性较高的7条序列构建系统进化树，结果显示，真菌SP14与两株篮状菌聚为一支且这两支分支的同源性较高，确定真菌SP14为TalaromycesRugulosinSP14（图1,2）。
2.2发酵条件的优化
在以活性为指标的真菌筛选中，发现TalaromycesRugulosinSP14上下层培养基颜色不一（上黄下青），推测光照可能影响了真菌SP14的次级代谢产物谱。以光照为变量，进行光照和避光培养。结果显示，光照组于第三天观察到黄色化合物，同时HPLC显示，与避光组相比，在保留时间22.3min处，光照组检测出一个特征峰，且随着发酵时间的延长而变成主要次级代谢产物，而避光组在此保留时间则没有特征峰出现，结合培养基颜色状态及HPLC检测曲线，确定该黄色化合物为活性化合物（图3）。
图1Lane1:2KMarker;Lane2:5.8SrDNA
图2SP14系统进化树
图3光照与避光组HPLC检测曲线（D-DarkL-Light)
2.3化合物结构鉴定
黄色化合物：固体，易溶于DMSO，分子式为C30H22O10。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)，δ：14.60(2H,brs,1-OH,1'-OH),2.76(2H,d,J=5.17Hz,H-2,H-2'),4.41(2H,s,H-3,H-3'),5.40(2H,brs,3-OH,3'-OH),3.38(2H,brs,H-4,H-4'),7.45(2H,d,J=1.2Hz,H-6,H-6'),7.18(2H,d,J=1.2Hz,H-8,H-8'),11.58(2H,s,9-OH,9'-OH),2.42(6H,s,H-15,H-15')。13C-NMR(500MHz,DMSO-d6)，δ：186.0(C-1,C-1'),58.4(C-2,C-2'),68.5(C-3,C-3'),47.8(C-4,C-4'),55.6(C-5,C-5'),120.4(C-6,C-6'),147.4(C-7,C-7'),123.9(C-8,C-8'),160.2(C-9,C-9'),114.2(C-10,C-10'),180.6(C-11,C-11'),106.0(C-12,C-12'),194.0(C-13,C-13'),131.9(C-14,C-14'),21.4(C-15,C-15')。以上数据与文献中[2]报道基本一致，确定其为Rugulosin。
3、讨论
本文研究了从南极海泥中分离筛选出来的一株篮状菌Talaromyces RugulosinSP14，通过白光光照稳定了活性次级代谢产物的发酵并从其固体发酵物中分离出来一种活性次级代谢产物Rugulosin，文献报导，该化合物对MRSA有比较好的抑菌活性[2]，其MIC值为0.125ug/ml。Rugulosin最先自Penicillium rugulosum菌中分离出来，前期研究显示，Rugulosin对HIV病毒有抑制作用[3]，并且对链球菌及棒状杆菌有很强的抑制活性，并能引起枯草芽孢杆菌DNA损伤，但对革兰氏阴性菌抑制作用较小[4]，对大鼠肝脏和大肠杆菌的核糖核酸聚合酶以及大鼠肝脏和梨形四膜虫的核糖核酸酶H也有比较强烈的抑制作用[5]。部分研究显示，真菌来源的Rugulosin对热休克蛋白90(Hsp90)的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性有较强的抑制作用，分子对接显示，Rugulosin与Hsp90N端之间存在较强的相互作用，二者通过氢键形成静态复合物同时可以使Hsp90N端的α-螺旋含量下降3.4%，从而使Hsp90N端的二级结构发生改变[6]。在一些肿瘤细胞中，Hsp90可以维持较高的表达量，继而影响多种肿瘤相关蛋白，如Bcr-abl,Akt,C-Raf,CDK4以及Her2等的表达[7]，所以Hsp90抑制剂可以作为抗肿瘤细胞的先导化合物，因此有潜力进一步将Rugulosin开发成为分子探针去研究与Hsp90相关的信号通路[8]。此外Rugulosin作为一种真菌毒素，已被ABcam公司开发为RNA聚合酶的小分子抑制剂。在农业应用上，Rugulosin具有抗菌和杀虫活性，在一些植物内生真菌的次级代谢产物中也发现有Rugulosin的存在，因此将其用作一种生物杀虫剂，以减少化学杀虫剂的使用，是一种环境友好型的生物杀虫剂[9]。
本研究首次报道了白光光照对篮状菌属真菌活性次级代谢产物的影响，将避光粗提物置于光照培养箱中光照刺激，HPLC没有检测出Rugulosin的存在，说明其并不是光照催化而形成的，而是由真菌自身代谢形成，其中可能涉及到一些转录调控因子的参与。真菌可能为适应极地极昼极夜环境而进化演变出独特的对光敏感的次级代谢机制，光照因素也为今后研究极地海洋真菌次级代谢产物提供一个新的思路和依据。
参考文献：
[6]陈俊杰,易玉婷,于淼等.Rugulosin对N-Hsp90的抑制与结合作用[J].高等学校化学学报,2011,32(1):88-94.
陈俊,陆园园.一株南极篮状菌光照活性产物研究[J].科学技术创新,2020(19):9-10.
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2020-05-28我要评论
期刊名称：海洋学研究
期刊人气：1254
主管单位：国家海洋局
主办单位：中国海洋学会,国家海洋局第二海洋研究所,浙江省海洋学会
出版地方：浙江
专业分类：科学
国际刊号：1001-909X
国内刊号：33-1330/P
创刊时间：1983年
发行周期：季刊
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2020-07-03
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