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探究海洋环境遭受微塑料破坏后对珊瑚的影响

2020-02-21 291 上传者：管理员

摘要：海洋微塑料严重威胁着海洋生物的生存及人类的健康。为了探研我国海南岛近海珊瑚礁常见珊瑚肉芝软珊瑚受到微塑料的哪些影响，进行本实验，在微塑料环境中放入肉芝软珊瑚，使其长时间暴露于此，并进行共生藻密度、叶绿素a含量和SOD，CAT，AKP，ACP和GST活性测定，结果显示：在微塑料胁迫后，共生虫黄藻的密度在第1天开始显著下降，并在15天后达到最低值(1.52±0.06)×106cell/cm2(P<0.05);叶绿素含量在50天内显著下降，在第50天时达到最低值3.45±0.35μg/cm2;SOD活性和CAT活性在3天内显著升高，并在第三天达到最高值，分别为34.39±1.33U/mgprot和34.80±1.51U/mgprot，此后显著下降;同样GST活性也迅速上升，在第1天和第15天出现两个峰值，分别是1.22±0.04U/mgprot和1.33±0.04U/mgprot;而ACP与AKP活性也有迅速下降趋势。本次实验为珊瑚礁生态恢复提供了部分理论依据。

关键词：
叶绿素
微塑料
肉芝软珊瑚
虫黄藻
酶活性
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塑料产业的快速发展不仅仅带来经济的提升，同时也引起了诸多污染问题。如今世界塑料年产量已经超过3亿吨[1]，其中大量塑料制品通过陆地径流，捕捞行业和其他方式进入海洋成为海洋中的白色污染[2-3]。这些塑料制品通过长时间的光解，热氧化，水解，磨料和生物风化变成直径在5mm以下的微塑料[4-5]。由于陆地是塑料的主要来源，珊瑚礁等沿海生态系统受到的影响更加严重[6-8]。不同珊瑚礁生物因为不同的生活史和摄食行为对微塑料的反应各不相同[9]，Hall等[10]也证实了大量微塑料能通过珊瑚的滤食行为进入珊瑚体内。

氧化还原系统是珊瑚识别和清除病原生物或物质的重要防御系统，环境的改变会使珊瑚氧化还原系统发生改变。如Levy等[11]发现光谱波长对正菊珊瑚(Faviafavus)的超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性产生影响。Tatiana等[12]也从热应激和高光角度对珊瑚SOD、CAT和谷胱甘肽转移酶(GST)活性变化进行了相关研究。微塑料作为外源物被珊瑚摄入会对其氧化还原系统产生影响也在Tang等[13]的研究中得到证实，但从24h内急性微塑料环境暴露所得的实验结果仍无法反映自然海域珊瑚长时间暴露的情况。

软珊瑚是珊瑚礁生态系统中重要的组成部分，具有极强的药用价值。我国南海软珊瑚种类资源十分丰富，但目前国内对软珊瑚的研究处于停滞状态。在南海高浓度微塑料环境下[14]，探究长时间微塑料环境暴露对软珊瑚影响尤为重要。本研究中，笔者以三亚市西岛珊瑚礁保护区常见种花环肉芝软珊瑚(Sarcophytontrocheliophorum)为研究对象，在实验室条件下，从珊瑚共生藻密度，叶绿素含量，SOD活性，CAT活性，碱性磷酸酶(AKP)活性，酸性磷酸酶(ACP)活性和GST活性的角度出发，研究花环肉芝软珊瑚对长时间微塑料环境暴露下的胁迫响应，旨在阐明海洋环境遭受微塑料破坏后对珊瑚的影响，为珊瑚礁生态恢复提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 珊瑚采集

一株花环肉芝软珊瑚活体样品采自西岛珊瑚礁自然保护区(18°14′57″N，109°22′51″E)。运回实验室后暂养于水族箱(规格为70cm×50cm×60cm)，暂养条件与晁华等[15]方法一致(水温28℃，盐度34‰，光暗比12h︰12h，水流循环2000L/h)。暂养一周后，用解剖刀将珊瑚分解成规格大小约5×5cm的小个体，黏附于陶瓷底座后继续暂养2周。

1.2 微塑料暴露

根据Tang等[13]的方法在处理组中添加直径为1μm的单分散聚苯乙烯微塑料(1.4×109粒/mg)(塞尔群，天津，中国)，海水中微塑料浓度为50mg/L，7×1010粒/L。分别将触手伸展正常的30个珊瑚个体(共60个)放置于对照组(海水中微塑料浓度为0)与处理组两个水族箱中，条件与暂养条件一致，养殖期间通过少量曝气防止微塑料沉积聚集，微塑料均能悬浮于海水中。实验周期内自然蒸发的水体会通过添加过滤海水进行补充，以保持水族箱内微塑料的浓度。在养殖0，1，3，7，15，30，50天分别在两个水族箱中随机挑选3个珊瑚个体采样标号，保存于液氮中备用。

1.3 共生藻密度测定

根据雷新民等[16]方法进行改进，取珊瑚组织与10mL左右的磷酸缓冲液(PBS，pH=7.4)进行研磨匀浆。量取9mL匀浆液与1mL甲醛混匀，静置3min后用离心机在4500r/min，4℃离心15min，取上清液用血球计数板计数(个/mL)。使用铝箔法[17]测量珊瑚表面积，共生密度被定义为每单位面积珊瑚的共生体的数量(个/cm2)。

1.4 叶绿素a含量测定

参照Hedouin等[18]的方法，2mL组织匀浆液在2400r/min，4℃下离心10min以获得珊瑚共生虫黄藻，随后在PBS中重新悬浮，在4500r/min，4℃下离心30s后用2mL丙酮在黑暗条件下4℃下萃取24h。在630nm，647nm和663nm处测定提取液的吸光度值。使用以下公式计算：Chl=11.85A6631.54A6470.08A630式中，Chl为珊瑚表面单位面积叶绿素a含量(μg/cm2)，A为不同波长下的吸光值。

1.5 SOD，CAT，AKP，ACP和GST活性测定

准确称取组织重量，按重量(g)︰体积(mL)=1︰9比例加入生理盐水后置于冰浴的研钵中迅速研磨成10%的匀浆。用冷冻离心机离心(3000r/min，10min，4)，℃取定量上清液用生理盐水稀释，使用试剂盒(A001，A007，A059和A004，南京建成，中国)测定稀释液中SOD，CAT，AKP，ACP和GST活性，最后用BCA蛋白浓度测定试剂盒(QS3202，索莱宝，中国)测定各样品总蛋白含量，分别使用公式计算将5种酶活性单位统一为U/mgprot。

1.6 数据分析

采用SPSS13.0统计软件对各时间点进行单因素方差分析(One-wayANOVA)和Duncan多重比较，以α=0.05作为差异显著水平，同时对照组与微塑料胁迫组进行独立样本T检验。描述性统计值采用平均值±标准误表示。

2、结果

2.1 单位面积共生藻密度

从对照组可以发现，花环肉芝软珊瑚在常规养殖环境下，其表面单位共生藻密度趋于稳定，不同时间点差异不显著(表1)。在微塑料暴露下，花环肉芝软珊瑚共生虫黄藻密度在1天后出现最大值，分别为(2.83±0.11)×106个/cm2，与对照组差异显著(P<0.05)，并在第15天(1.52±0.06)×106个/cm2出现最小值。随着胁迫时间的延长，珊瑚表面单位面积共生虫黄藻密度总体变化趋势是逐渐减少，并在多数时间点与对照组差异显著(P<0.05)。

表1珊瑚的表面单位面积共生藻密度/(106个/cm2)

2.2 单位面积叶绿素a含量

随着时间的延长，对照组珊瑚表面单位面积叶绿素含量趋于减少，在第50天达到最小值(2.58±0.06)μg/cm2，与前7天各时间点差异显著(表2)。在微塑料暴露下，叶绿素含量在1天后出现最大值(2.81±0.05)μg/cm2，与对照组差异显著(P<0.05)，并在第7天出现最小值(2.03±0.05)μg/cm2。随着胁迫时间的延长，珊瑚表面单位面积叶绿素含量总体变化趋势是逐渐减少，并在多数时间点与对照组差异显著(P<0.05)。

2.3 微塑料对珊瑚SOD活性的影响

对照组中珊瑚SOD活性在各时间点趋于稳定，数值在(23.41±0.38)U/mgprot和(24.54±0.347)U/mgprot间波动而未有显著差异(表3)。微塑料胁迫后，珊瑚SOD活性在第3天达到峰值(34.39±1.33)U/mgprot后呈现缓慢下降趋势，在第30、50天到达较低值，分别为(28.55±0.34)U/mgprot、(28.63±0.34)U/mgprot。与对照组相比，微塑料胁迫后珊瑚SOD活性在各时间点显著高于对照组(P<0.05)。

表2珊瑚的表面单位面积叶绿素a含量/(μg/cm2;表3珊瑚SOD活性/(U/mgprot)

2.4 微塑料对珊瑚CAT活性的影响

对照组中珊瑚CAT活性在最低值(25.59±0.72)U/mgprot和最高值(28.61±0.80)U/mgprot间波动(表4)，微塑料胁迫后短时间内珊瑚CAT活性迅速升高，并在第三天到达峰值(34.80±1.51)U/mgprot后缓慢下降。与对照组相比，微塑料胁迫后珊瑚CAT活性在各时间点高于对照组，并在多数时间点差异显著(P<0.05)。

2.5 微塑料对珊瑚AKP活性的影响

在未添加微塑料的对照组中，珊瑚AKP活性随时间延长在最低值(2.58±0.06)U/mgprot和最高值(2.81±0.05)U/mgprot间波动(表5)。微塑料胁迫1天后AKP活性升高到达峰值(2.81±0.05)U/mgprot，但与对照组未有显著性差异。随着胁迫时间的延长，珊瑚AKP活性总体变化趋势是逐渐减少，在多数时间点与对照组差异显著(P<0.05)。

表4珊瑚CAT活性/(U/mgprot);表5珊瑚AKP活性/(U/mgprot)

2.6 微塑料对珊瑚ACP活性的影响

对照组中珊瑚ACP活性在0到30天内各相邻时间点间显示存在显著性差异(表6)，但最小值(0.62±0.02)U/mgprot仍远大于添加微塑料后的处理组出现的最大值(0.57±0.02)U/mgprot。处理组添加微塑料后珊瑚ACP活性迅速下降，在第3天和第15天出现两个谷值，分别是(0.52±0.02)U/mgprot和0.51±0.02U/mgprot。随时间延长，各时间点处理组珊瑚ACP活性均低于对照组，存在显著性差异。

2.7 微塑料对珊瑚GST活性的影响

对照组中珊瑚GST活性在最低值(0.81±0.02)U/mgprot和最高值(0.96±0.02)U/mgprot间波动(表7)，在第15天出现峰值(0.96±0.02)U/mgprot，但仍小于添加微塑料后的处理组。处理组添加微塑料后珊瑚GST活性迅速上升，在第1天和第15天出现两个峰值，分别是(1.22±0.04)U/mgprot和(1.33±0.04)U/mgprot，在各时间点均维持较高水平。随时间延长，各时间点处理组珊瑚GST活性均高于对照组，存在显著性差异。

表6珊瑚ACP活性/(U/mgprot);表7珊瑚GST活性/(U/mgprot)

3、讨论

人类活动对海洋生态系统产生重大影响，塑料排放成为保护海洋生物多样性的一个关键挑战[18]。已有证据证明微塑料会损害桡足类和螃蟹的摄食能力[19-20]，同时还会导致浅水珊瑚肠腔积聚甚至白化死亡[21-22]。本研究中，花环肉芝软珊瑚在微塑料环境胁迫下其表面单位共生藻密度和表面单位叶绿素含量均会出现短暂的升高，这与Tang等[13]研究的结果相一致。在长时间胁迫下，共生藻密度与叶绿素含量持续下降，这与微塑料对海洋微藻叶绿素含量和光合效率有负面影响的报道趋于一致[23-24]。雷新明[25]认为共生藻和叶绿素含量变化是胁迫响应的指示因子，而他提出的叶绿素含量变化会滞后于共生藻密度变化的现象在本研究中并未出现。

此外，免疫系统是负责识别和清除病原生物或物质的宿主防御系统。SOD和CAT作为珊瑚氧化还原系统中的主要抗氧化酶[11]，在环境胁迫下对自由基进行清除，这是机体对不良环境的一种适应机制。过度的氧化应激被认为是珊瑚共生系统崩溃的主要诱因[26]。本实验结果表明SOD和CAT活性的升高对维持微塑料急性胁迫后共生系统的稳定性产生影响，共生虫黄藻的密度及叶绿素含量均出现降低。同时，在对GST活性测定后发现，作为所有真核生物解毒过程中的关键II期代谢酶[27]，GST酶活性也在微塑料胁迫下出现了显著升高并持续维持在高水平状态。已有证据证明如疏水化学物质或添加剂等小分子化学物质进入细胞能够迫使机体免疫系统做出反应[28]，实验中聚苯乙烯微塑料中含有的多氯联苯(PCBs)和多环芳烃(PAHs)可能也是导致SOD，CAT和GST酶活性升高参与免疫反应的因素之一。Tang等[13]在报道中指出微塑料暴露可能会导致JNK和ERK信号通路受到调节，磷酸化过程受到抑制，本实验中，AKP与ACP酶活性均受到不同程度的抑制，这与Tang得出的结论一致。Chapron等在研究中指出微塑料环境能够影响珊瑚钙化[29]，因碱性磷酸酶与钙化存在紧密联系[30]，微塑料胁迫对珊瑚骨针的影响也将在今后的实验中进行探索。

4、结论

在长时间高浓度微塑料环境胁迫下，花环肉芝软珊瑚未出现死亡个体，触手伸展活力与对照组无显著性差异。但其共生虫黄藻密度与叶绿素含量均出现下降并维持在较低水平，营养供给能力的下降加大了珊瑚感染致病菌甚至白化的可能。同时微塑料环境下珊瑚的SOD，CAT和GST酶活性均维持在高水平，而AKP与ACP酶则受到不同程度的抑制，这些生化指标都反映花环肉芝软珊瑚在长时间高浓度微塑料环境胁迫下处于异常状态。本研究对花环肉芝软珊瑚在长时间微塑料环境暴露的生理生化指标进行初步研究，阐明海洋环境遭受微塑料破坏后对珊瑚的影响，为珊瑚礁生态恢复提供了部分理论依据。

陆昊,李卫东,王沛政.长时间微塑料环境暴露对肉芝软珊瑚的影响[J].海洋科学,2019,43(11):49-55.

基金项目:2016年海南省重大科技计划(ZDKJ2016009-03)