牙周组织工程是利用细胞生物学与工程学原理，在生物体上获得相应的目标种子细胞后，体外增殖并接种到生物相容性较好的细胞支架上，在提供生长因子微环境的条件下，经过一段时间的继续培养，形成具有一定结构、外形和功能的组织，是重建牙周组织最理想的手段[1]。口腔领域研究人员将这一理论引入到牙周疾病的治疗，很大程度上推动了牙周重建研究的发展。组织工程体外实验的3个基本要素包括：信号、细胞和骨架[2]。在牙周重建组织工程学中，细胞和支架的选择相对集中，而生物信号的选择空间却非常广阔[3,4]。目前何种基因可作为较好的信号被应用于牙周组织工程成为了关键性问题，可单纯依靠传统的生物实验手段来验证庞杂的候选基因是不现实的，所以学者们开始依靠生物信息学手段来筛选目标信息。

有研究于2019年利用基因数据库进行生物信息学分析来诊断和预测慢性牙周炎分子生物标志物候选物以及主要生物标志物候选物的上游调控基因[5]。王宝华等[6]利用数据库中健康人与牙周炎患者牙龈组织的基因数据进行生物信息学分析，筛选出了牙周炎组织中miRNAs的表达谱，并预测hsa-miR-1260和hsa-miR-451可能在牙周炎的进展当中起到重要作用。但是截至目前，作者检索国内外文献后还未发现通过基因数据库对牙周重建进行生物信息学研究的文章。

文章通过利用生物信息学技术可以帮助分析和处理大量的实验数据的优势，整合生物信息学的经典基因数据库，开创性地构建出牙周重建相关的级联调控通路，筛选出牙周重建过程中关键性的启动基因，为未来临床牙周炎等需重建牙周组织的疾病锚定生物工程学治疗的优选基因。

1、资料和方法

1.1 设计

生物信息学实验。

1.2 时间及地点

于2018年分别在哈尔滨医科大学生物信息科学与技术学院、哈尔滨市儿童医院完成。

1.3 检索策略

牙周重建生物功能主题词选择：牙周组织包括硬(牙槽骨与牙骨质)和软(牙周膜与牙龈)两种组织，见图1，他们的生物学成分主要是源于多种功能性细胞合成的骨组织与胶原纤维，而提供功能性细胞的是存在于牙周膜中的干细胞或者祖细胞。牙周疾病的表现就是软硬组织的破坏，临床各种牙周治疗的手段旨在重建这些组织成分。所以，牙周重建过程主要可以归纳为以下几部分生物过程：“干细胞分化(分化为成纤维细胞、成牙骨质细胞以及成牙槽骨细胞)”“骨组织改建(成骨细胞的分化与增殖)”以及“牙周软组织形成(成纤维细胞增殖和胶原合成)”，确定上述生物活动对应的查找主题词分别为：stemcelldifferentiation、osteoblastdifferentiation/osteoblastproliferation、fibroblastproliferation以及collagenbiosynthetic。

1.4 方法

1.4.1 牙周重建各生物功能交集基因的确定

从GeneOntology数据库提取出和上述生物学过程相关的所有基因，包括基因和基因产物，建立各生物功能的基因集合，分析牙周重建单一生物功能所包含的基因数和各生物功能交集的基因。

1.4.2 建立预测牙周重建相关的级联调控通路

首先，构建实验证实的转录因子和miRNA复合调控网络。文章从TRANSFAC(version11.4)数据库下载转录因子对基因的调控关系。由GENE、SITE、CLASS、FACTOR、CELLS、METHOD、MATRIX和REFERENCE等数据表构成[8]。TransmiR(version1.2)数据库提供了实验证实的转录因子对miRNA的调控[9]。MiRNA对靶基因的调控信息来自miRTarBase(release2.5)数据库[10]。miRecords(version3)数据库存储了真实的和预测的miRNA对靶基因的调控关系，文章只使用人类实验证实的miRNA调控靶基因的关系对[11]。最后，还从TarBase(version5.0)数据库中获取了部分实验证实的miRNA靶基因信息[12]。整合5个数据库的信息形成了实验证实的转录因子和miRNA复合调控网络，此网络内包含miRNA、转录因子和靶基因相互的调控关系(所有调控关系都是实验证实的)，共包含3098个点，6039条边。

实验将牙周重建相关的生物学过程内的所有基因映射到调控网络内，如果一对牙周重建相关的基因在网络内直接相连，则保留这对基因，从而得到一个直接相连的牙周重建相关的核心子网。由于子网通常具有复杂的网络结构，而复杂的网络结构增加了对结果解读和实验验证的难度。因此，作者对上一步得到的核心子网进行深入分析，用广度优先算法将这一子网内的所有线性通路挖掘出来，每条通路内都包含转录因子和靶基因。找到网络内的所有入度为0的基因到出度为0的基因的级联调控通路，入度为0意味着这一基因不受任何基因调控，出度为0意味着这一基因不调控任何基因，上游的基因激活会调控下游的基因，文章认为在通路内上游的基因更为重要。实验将上游起始基因称之为一级基因，起始基因下游的称之为二级基因，再下一层的称之为三级基因。通路的挖掘过程如下：首先，使用广度优先算法去遍历网络中的每一个节点；然后，通过回溯提取出网络中入度为0的点到出度为0的点[13]。如图2所示，实验识别了所有的通路，这些通路都是入度为0的点到出度为0的点，包括1→2→4→7,1→2→5→7,1→3→6→8。

1.5 主要观察指标

牙周重建各生物功能的交集基因及相关的核心子网。

2、结果

2.1 牙周重建单一生物功能所包含的基因数

通过数据库查找文章发现，干细胞分化包含了54个不同基因、骨组织改建(成骨细胞分化/增殖)包含203个不同的基因，成纤维细胞增殖包含76个不同基因，胶原合成这一生物学进程包含了34个基因、成纤维细胞增殖包含76个不同基因，这一信息的统计结果见表1。

2.2 牙周重建各生物功能的交集基因

2.2.1 每两种生物功能之间的交集基因

在对不同生物学过程包含的基因求交集的时候发现，干细胞分化和骨组织改建之间的交集基因数量最多，有11个，而干细胞分化与胶原合成之间不存在交集基因，其他生物学过程中都包含了2-11个交集基因，详细的信息见表2。其中交集基因中出现频次最高的是细胞周期蛋白依赖激酶6(CDK6)和分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)这2个基因，分别出现在“干细胞分化-骨组织改建”“干细胞分化-成纤维细胞增殖”“骨组织改建-成纤维细胞增”的交集基因中。

2.2.2 生物功能的交集基因

通过表2可见，干细胞分化、骨组织改建及成纤维细胞增殖三者间有2个交集基因，分别是CDK6和SFRP1。

2.3 调节基因的上下游通路关系

使用上述生物学过程内包含的全部基因映射到背景调控网络中，直接相连基因形成的子网包含了45个基因，37条调控关系，文章认为这个网络是与牙周重建密切相关的核心子网，见图3，不同颜色代表不同的生物学功能。

基于核心子网使用广度优先算法挖掘了网络内所有入度为0的点到出度为0的点的所有通路，一共找到了34条通路，这些通路内最长的包含6个基因，最短的包含3个基因。其中长度大于3的通路中作为上游调控牙周重建的基因中出现频次较高的有3个一级基因：骨形态发生蛋白7、信号转导因子3(SMAD3)和核转录因子2(PAX2);2个二级基因：RUNX2和JUN;2个三级基因：ESR1和GNAS。

3、讨论

从牙周重建单一生物功能所包含的基因数来看，目前对骨组织改建相关基因的研究最多，对胶原组织合成的相关基因研究最少。分析牙周重建各生物功能两两对比的交集基因，胶原合成生物功能与其他功能交集少，骨组织改建功能与其他各项功能的交集都较多。这一结果提示，就目前牙周重建研究成果来说，骨组织改建有可能是牙周重建最关键的生物功能。干细胞分化、骨组织改建以及成纤维细胞增殖3者间的交集基因是细胞周期依赖性激酶6(CDK6)和分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)，涵盖于牙周各软硬组织的形成过程中，作者认为这2个基因可能是牙周重建过程中较重要的基因。

在通路研究中上游的基因有很重要的研究意义，他们可能是整条通路的开关，会影响下游一系列基因。通过对调节通路的分析文章可以发现，在通路长度大于3的通路内，所有的通路都是以骨形态发生蛋白7、PAX2或SMAD3起始的。这3个基因分别与牙周重建中骨组织改建和干细胞分化有关，由此文章推测牙周重建应该开始于这两种生物功能。以往很多研究已经发现骨形态发生蛋白7对牙周重建有促进作用[14]，对文章结果是一个佐证。另外2个基因SMAD3和PAX2作为通路的起始基因，它们也可能是潜在的重要的牙周重建调控基因，这些推测需要通过进一步生物学研究手段来证实。

除了上述3种通路起始基因外，比邻起始基因、其上游只有单一基因的还有2个二级基因：RUNX2(骨改建和干细胞分化的交集基因)和JUN(成纤维细胞增殖功能)。因其上游单一来源，可以作为良好的调控节点来设计控制整个牙周重建发生的实验。

整合所有上述文章认为是关键调节点的基因，将它们目前在口腔专业领域的研究现状做一汇总，具体见表3。

细胞周期依赖性激酶6(CDK6)：迄今为止在口腔领域的相关研究只涉及牙龈成纤维细胞和牙囊细胞的增殖和更新[15,16]。CDK6作为细胞周期依赖性激酶家族中的一员，它的主要功能在于：(1)决定细胞命运相关因素，如非对称定位和销毁时间；(2)结合调控细胞分化方向的信号；(3)保持有丝分裂区以保持干细胞的增殖能力[17,18]。截至目前关于CDK6和牙周组织的相关研究比较少，尚无学者研究CDK6和牙周重建的关系。

分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)：是经典Wnt信号转导通路的拮抗剂，它能够抑制Wnt的信号传导，进而影响下游的细胞成骨分化。有学者发现，牙囊干细胞不管是否与牙髓干细胞共培养，SFRP1表达水平不变，而且牙囊干细胞保留他们形成牙周组织的潜力，说明干细胞可以根据他们周围的环境而改变他们的行为，但同时也保留他们的遗传记忆[19]。通过骨Ca2+素绿色荧光蛋白转基因小鼠研究发现成牙骨质细胞比成骨细胞中SFRP1表达量高，可作为一项标志性识别物[20,21]。池毓坦等[22,23]发现SFRP1及β-连环蛋白在慢性牙周炎患者牙龈组织中的表达升高且与牙周的破坏相关，二者的异常表达可能促进牙周炎的发生发展。

骨基质形成蛋白7：具有促进牙周膜干细胞增殖和诱导牙周成骨的作用[24,25,26]。要完成牙周组织重建，除了种子细胞的选择之外，也离不开促骨分化生长因子的选择，因子中应用较多的就是骨形成蛋白家族。骨形成蛋白家族属于转化生长因子β超家族成员，在骨骼发育和干细胞分化过程当中起关键作用。

信号转导因子3(SMAD3)：具有介导牙本质细胞矿化、诱导牙髓细胞增殖、牙周膜干细胞分化、成骨和趋化运动，作为一种调控因子，与牙体组织和牙周组织的发生发展都有着密切的关系。有学者研究了该基因对牙本质细胞矿化能力和牙髓细胞增殖情况的调节作用，注重的是牙体组织的发生和形成方面[27,28,29]；而一些专家将该基因与牙周组织的改建活动联系起来，发现在牙周膜干细胞(PDLSCs)分化成牙槽骨细胞以及成骨的过程中，是通过SMAD2/3和p38通路调节的，转化生长因子β/SMAD3参与多种干细胞的调控，在SMAD3下游的转录因子中有非常多的成骨相关因子[30,31]。从既往的研究结果可见，文章在“预测牙周重建相关的级联调控通路”中只体现出SMAD3与成骨有关是不全面的，该基因还与细胞的迁徙有关。

核转录因子2(PAX2)：是PAX基因家族的一员，在胚胎发育时期对组织和器官形成起至关重要的作用。PAX基因家族的成员也在出生后维持一定的细胞正常功能，但对于牙周组织的修复再生功能未见相关报道。实验在对PAX2基因再生功能的调控机制进行分析时发现，其相关调节机制中部分调节通路与牙周组织重建的经典通路相符，因此，该基因将是下一步研究的工作重点。

RUNX2：是一种与力学有关的因子，在机械力作用下可以诱导该因子在细胞内的表达。RUNX2在牙周膜成纤维细胞中表达，当它受到抑制时主要是为了保持牙周膜宽度不再进一步增大，在机械应力环境下，牙周膜细胞变性提高了RUNX2的表达，蛋白水平和脱氧核糖核酸结合并活化，后者可能是受活化的ERK/MAPK信号通路调节的[32,33]。有学者发现微量的氟化钠可以通过Runx2信号通路促进成骨细胞分化，并可能有效治疗骨相关疾病[34]。很多学者也证实了牙周组织中的牙周膜细胞、成骨细胞均为RUNX2的靶细胞[35,36]。也就是说，机械外力可以作用于多种牙周细胞并诱导RUNX2的表达，从而保持牙周膜的宽度和刺激细胞功能。

JUN：在控制细胞是否恶变方面可发挥重要的作用。目前关于JUN的研究主要是关于牙体组织-牙釉质、牙本质的形成与发育方面。逄键梁等[37]发现c-Jun和c-Fos可以降低人牙本质基质蛋白1基因的转录活性，是人牙髓干细胞向成牙本质细胞方向分化的重要调控因子。徐畅等[38]发现c-Jun在釉质发育的早期，通过上调釉原蛋白的表达参与釉质的发育，而JunB在釉质发育的晚期通过抑制釉原蛋白的分泌促进釉质的成熟。国外有学者发现，Jun诱导人牙周膜干细胞的迁移和成骨分化[39,40]。

以上文章所论述的3个一级基因SMAD3、骨形态发生蛋白7和PAX2在现有文献资料当中并没有查询到彼此之间直接的信号关联，但是它们所在基因家族的一些成员共存于某些经典信号调节通路当中，见图4[41]。

Smad4是骨形态发生蛋白各类信号传导过程中共同需要的介质。骨形态发生蛋白发挥调控机制最经典的信号通路之一就是骨形态发生蛋白-Smads。骨形态发生蛋白有Ⅰ型和Ⅱ型两种跨膜受体，其中Ⅰ型受体胞内的结构区段具有激酶活性，能够使受体活化型R-Smad(Smad1,2,3,5,8)磷酸化后，进而诱导相应的功能基因转录和表达。骨形态发生蛋白发挥调控机制的另一个经典通路是骨形态发生蛋白-MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号通路，它参与牙周膜干细胞的成骨分化，涵盖p38(p38蛋白激酶家族)、JNK(c-JunN端激酶)和ERK(胞外信号调节激酶家族)，以上2条通路都能调控下游RUNX2的成骨基因表达，进而影响细胞的成骨分化。此外，有研究表明，PAX2能够增强RUNX2的转录活性，并激活MAPK通路基因(p38,JNK,ERK)[42]。

链状调控通路的每条通路都至少包括3种基因，而且近半数(15/34)通路所包含的基因都涉及3种生物功能，暗示其与牙周重建的整体过程密切相关。按不同生物功能归纳，链状调控通路包含成骨细胞分化/增殖功能相关基因共9个、成纤维细胞增殖功能相关基因共7个、干细胞分化功能相关基因共2个、干细胞分化和成骨交集基因共3个、成骨和胶原合成交集基因1个，不包含胶原合成功能相关基因。通过调控通路中包含各功能相关基因的数量可以看出，牙周重建过程中成骨和成纤维细胞增殖活动最活跃、最有意义，各自之间调节关系纷繁复杂。同时，在链状调控通路中无胶原合成功能调节作用，说明在牙周重建过程中胶原合成功能属非重要环节。

对网络进行研究的时候文章发现网络内不仅有链状的调控通路，还有一些环状通路，起始基因也是来源于成骨功能和成纤维细胞增殖功能，进一步说明这两个功能可能是启动牙周重建的关键功能。在环状通路中出现了惟一的1个和胶原合成功能相关的基因——过氧化物酶体增殖物激活受体基因(PPARG)，但是处于调节通路下游，该基因目前在国内研究中没有与口腔领域相关的内容。

无论是链状调控通路还是环状调控通路，上游起始基因大多数是来源于“成骨细胞分化/成骨细胞增殖”这项生物功能的，由此可以断定牙周重建这一复杂的生物活动极有可能是开始于此项生物功能，这项功能发生在牙周组织中软硬组织交界区域。而下一级基因多数来源于“成纤维细胞增殖”，可见牙周重建过程中第2项生物活动应该是集中发生在软组织牙周膜中。综上所述，牙周重建的信号调控十分复杂，文章所预测的牙周治疗基因靶点还需后续的通过生物实验加以验证。

综上所述，牙周重建各功能最大交集的2个基因是CDK6和SFRP1。预测在牙周重建过程中起关键性调节作用的基因有：3个起始基因，SMAD3、骨形态发生蛋白7和PAX2;2个二级基因，RUNX2和JUN。作者推断牙周重建过程可能开始于骨组织改建，包括成骨细胞分化和成骨细胞增殖，接下来是牙周软组织的成纤维细胞增殖。

参考文献:

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文章来源：冯冬菲,何洪旭,谢琪,张立立,周惠,李威.牙周重建生物功能与调节通路关键基因的筛选[J].中国组织工程研究,2022,26(02):253-259.