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茅岩莓提取物治疗放射性口腔溃疡的作用研究

2023-09-25 46 上传者：管理员

摘要：采用X射线复制大鼠放射性口腔溃疡模型，对茅岩莓提取物治疗放射性口腔溃疡的效果进行评价。方法 SD大鼠60只，雌雄各半，随机分为正常对照组，模型对照组，金因肽组(5000 IU•kg-1)，茅岩莓提取物低、中、高(16、32、64 mg•kg-1)剂量组，每组10只。各组大鼠按15 Gy剂量采用X射线照射大鼠口部及内侧口腔黏膜，复制放射性口腔溃疡模型。分别于造模后24 h进行药物干预，2次•d-1，连续14 d。每日对各组动物进行一般临床观察，定期监测体重、摄食量及口腔黏膜评分，末次给药后采集各组大鼠口腔黏膜，检测口腔黏膜组织中IL-6、TNF-α、IL-1β的含量，并进行组织病理学检查。结果金因肽和低、中、高剂量茅岩莓提取物均可提高动物体重增长率和摄食量；金因肽和中、高剂量茅岩莓提取物可显著降低口腔黏膜评分和IL-6表达(P<0.05,P<0.01)，减轻口腔黏膜病变程度；金因肽和高剂量茅岩莓提取物可显著降低口腔黏膜组织IL-1β表达(P<0.05,P<0.01)。

关键词：
口腔分泌腺体
放射性口腔溃疡
放射治疗
炎症因子
茅岩莓提取物
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放射性口腔溃疡是常见癌症头颈部恶性肿瘤的常见并发症，在放射治疗头颈部恶性肿瘤的过程中，放射线损伤口腔黏膜、腮腺、唾液腺等口腔分泌腺体，直接或间接地破坏口腔正常环境，进而导致放射性口腔溃疡的发生[1,2]。该病主要表现为口腔黏膜红斑、溃疡并伴随疼痛，间接导致患者摄入减少而带来体重下降，不仅严重影响患者的生活质量，且极易继发感染，对患者的生命造成严重威胁[3,4]。

茅岩莓为葡萄科植物显齿蛇葡萄，其主要有效成分为蛇葡萄素和二氢杨梅素等黄酮类化合物，是土家族民间习用的一种食疗药物[5]。大量研究表明，茅岩莓具有抑菌、消炎、镇痛等作用[6,7,8]。早在1996年有报道称，茅岩莓在民间可作为茶饮防治口腔炎症[9]。陈立峰等[10]使用茅岩莓总黄酮涂抹口腔黏膜溃疡新西兰兔，结果证明茅岩莓总黄酮可明显减轻口腔黏膜溃疡炎症，同时促进溃疡愈合。虽然已有大量文献证明茅岩莓对口腔溃疡具有修复功能，但其对放射性口腔溃疡的作用效果还未见报道。本研究利用茅岩莓的药理学作用，将其提取物采用涂抹方式作用于大鼠放射性口腔溃疡模型，并选用重组人表皮生长因子外用溶液作为阳性对照药，通过观察动物一般生理指标（体重、摄食量）和口腔黏膜评分，检测口腔黏膜组织匀浆液细胞因子以及组织病理学检查，探究茅岩莓提取物对治疗大鼠放射性口腔溃疡的作用效果，为临床使用提供科学理论依据。

1、材料

1.1实验动物

SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，8周龄，体重180～220 g[湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2019-0004]。饲养于湖南普瑞玛药物研究中心有限公司SPF级动物房[SYXK（湘）2020-0015]，饲养环境室温为24～26℃，相对湿度40%～60%,12 h昼夜循环饲养，喂食普通饲料，自由进食、饮水。实验操作均经湖南普瑞玛药物研究中心有限公司动物伦理审查委员会批准[审批号：IACUC-2022(3)025]。

1.2试药与仪器

茅岩莓提取物（批号：20210302，由湖南普瑞玛药物研究中心有限公司药学研究部采用水浸泡法制备[11],HPLC测得其浓缩液中二氢杨梅素质量浓度为320 mg·mL-1）。

重组人表皮生长因子外用溶液（金因肽，深圳市华生元基因工程发展有限公司，批号20210407），适用于烧伤创面、残余小创面、各类慢性溃疡创面（包括血管性、放射性、糖尿病性溃疡）以及供皮区新鲜创面等。

X-RAD225型生物学X射线辐照仪[汇佳生物科技（上海）有限公司]；台式高速冷冻离心机（湖南湘立）；Spectra Max i3x型多功能酶标仪（奥地利美谷光子公司）；DFC 420C型病理成像系统（德国Leica);BX43+MD50型生物显微镜+数码成像系统（日本奥林巴斯公司）；炎症因子检测ELISA试剂盒（黄石市艾恩斯生物科技有限公司）。

2、方法

2.1放射性口腔溃疡模型制备及药物处理

SPF级SD大鼠60只，按体重与性别随机分为6组，分别为正常对照组、模型对照组、金因肽组（2000 IU·m L-1，大鼠平均体重按200 g计，折算至大鼠给药剂量为5000 IU·kg-1）、茅岩莓提取物低、中、高剂量组（给药质量浓度分别为6.4、12.8、25.6 mg·m L-1，大鼠平均体重按200 g计，折算至大鼠给药剂量分别为16、32、64 mg·kg-1），每组10只。除正常对照组外，各组大鼠按5m L·kg-1腹腔注射20%乌拉坦麻醉后，使用15Gy剂量采用X射线照射（源皮距FSD=40.0 cm，剂量率为2.5 Gy·min-1）大鼠口部及内侧口腔黏膜，6 min/只，其余部位采用5 mm的铅皮遮住，照射后每只动物灌胃给予4 mL 0.9%氯化钠注射液。各组动物于造模24 h后进行给药，茅岩莓提取物各剂量组及金因肽组分别使用消毒棉签蘸取0.5 mL相应药物均匀涂抹在大鼠口腔溃疡处，2次·d-1，连续给药14 d；正常对照组和模型对照组按相同给药方法给予0.9%氯化钠注射液。

2.2检测指标

2.2.1一般临床观察

每日观察动物口腔黏膜的变化和动物一般行为活动，于D7、D14记录各组动物摄食量情况，于D4、D7、D10、D14对各组动物称重，计算体重增长率，体重增长率=（当日体重-给药前体重）/给药前体重。

2.2.2口腔黏膜评分[12]

于D4、D7、D10、D14根据RTOG急性放射损伤分级标准对各组动物口腔黏膜进行评分。评分标准，0级：无；1级：红斑/溃疡，计1分；2级：红斑破溃，计2分；3级：融合红斑、水肿、溃疡（≥1/2黏膜），计3分；4级：出血、坏死，计4分。

2.2.3口腔黏膜细胞因子检测

末次给药后各组大鼠按60 mg·mL-1腹腔注射舒泰50麻醉后实施腹主动脉放血安乐死，取左侧口腔黏膜组织，按1∶9(g/mL）加入0.9%氯化钠注射液，高速匀浆，制成口腔黏膜匀浆液，4℃下3000r·min-1离心15 min，取上清液，ELISA试剂盒检测上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β的含量。

2.2.4组织病理学检查

取右侧口腔黏膜组织置于10%中性甲醛溶液固定24 h,HE染色，镜下观察口腔黏膜组织病理学变化，同时对溃疡黏膜组织病理变化进行量化评分，参考文献[13,14]并结合模型实际情况设计评分标准：口腔黏膜上皮受损、糜烂，上皮细胞排列紊乱；炎症细胞浸润；血管充血，红细胞外渗；黏膜组织水肿。对上述4项组织病理学指标进行量化积分，分为无、轻度、中度、重度4级，分别计0、1、2、3分。

2.3统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以平均值±标准差表示，多个样本间的比较采用单因素方差分析，根据方差齐性检验，方差齐及不齐时分别使用LSD法和Tamhane’s T2分析。等级资料以频数计，采用等级资料秩和检验进行统计。P<0.05说明差异具有统计学意义。

3、结果

3.1一般体征观察

造模后D1模型动物口腔可见红肿，D3摄食减少，自主活动减少并伴有流涎，造模后D4～D10动物口腔黏膜泛白，形成一定的假膜，并伴有流涎。金因肽给药D4肉眼观察口腔溃疡症状有明显的改善，茅岩莓提取物中、高剂量组连续给药1周，动物摄食量较之前有明显增加，且流涎也有相应的改善，随着给药时间的延长，各组动物口腔溃疡症状均有不同程度的改善，其中茅岩莓提取物高剂量组对放射性口腔溃疡症状改善作用最为明显。

3.2对摄食量及体重的影响

如图1所示，与正常对照组相比，模型对照组大鼠体重增长较缓慢；与模型对照组相比，其余给药组大鼠体重明显增加，其中金因肽组和茅岩莓提取物高剂量组动物体重增长更为明显。如图2所示，与正常对照组相比，造模后大鼠摄食量显著降低（P<0.01）；与模型对照组相比，各给药组大鼠摄食量均无统计学意义，但随着给药时间的延长及茅岩莓提取物浓度的提高，各组大鼠摄食量均呈不同程度增长趋势。

图1茅岩莓提取物对放射性口腔溃疡大鼠体重增长率的影响

图2茅岩莓提取物对放射性口腔溃疡大鼠周摄食量的影响

3.3对口腔黏膜评分的影响

如图3所示，正常对照组未进行造模处理，因此不同时期口腔黏膜评分均为0分；与模型对照组比较，金因肽组于给药D4、D7评分显著降低（P<0.01），茅岩莓提取物低剂量组于给药D14评分显著降低（P<0.01），茅岩莓提取物中、高剂量组于给药D7、D10、D14评分均显著降低（P<0.01）。

3.4对口腔黏膜细胞因子的影响

如图4所示，与正常对照组比较，模型对照组TNF-α、IL-6及IL-1β水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）；与模型对照组比较，金因肽组、茅岩莓提取物中、高剂量组IL-6水平均显著降低（P<0.05或P<0.01），金因肽组、茅岩莓提取物高剂量组IL-1β水平均显著降低（P<0.01）。

3.5口腔黏膜组织病变的影响

如表1及图5所示，正常对照组动物镜下观察可见口腔黏膜上皮细胞完整，未见出血和溃疡病灶，且未见炎症细胞浸润；模型对照组动物镜下观察可见口腔黏膜上皮坏死脱落，局部溃疡灶，伴有出血，同时固有层少量炎症细胞浸润；造模后给予相应剂量的金因肽、茅岩莓提取物，口腔黏膜病变较模型对照组均具有不同程度的减轻。与正常对照组比较，模型对照组口腔黏膜病变评分显著增加（P<0.01）；与模型对照组比较，金因肽组和茅岩莓提取物中、高剂量组口腔黏膜病变评分显著降低（P<0.05或P<0.01）。

图3茅岩莓提取物对放射性口腔溃疡大鼠口腔黏膜评分的影响

图4茅岩莓提取物对放射性口腔溃疡大鼠口腔黏膜细胞因子的影响

4、讨论与结论

放射性口腔溃疡是电离辐射毒性所致的正常组织损伤，于1980年被认定为癌症患者放疗副作用[15]。虽然放疗技术不断更新，放射性口腔溃疡的症状较以往常规放疗已有明显减轻，但该病仍可导致患者口腔疼痛、吞咽困难、体重减轻及深部黏膜溃疡，部分患者由于不能耐受口腔黏膜炎带来的痛苦进而更换或中断放疗方案，导致局部肿瘤的控制在很大程度上受到限制[16,17,18,19]。有文献报道称，茅岩莓及其提取物含有多种活性成分，以二氢杨梅素为代表的黄酮类成分含量之高在植物界中极为罕见，具有明显的抗病毒、抑菌及抗炎等抗感染生物活性，且对口腔溃疡的修复具有积极影响[20]。本研究使用X射线成功复制放射性口腔溃疡模型，模型大鼠临床表现为摄食量减少，体重增长迟缓，黏膜出现不同程度溃疡；使用金因肽及不同浓度茅岩莓提取物处理大鼠口腔后，各给药组大鼠的体重和摄食量均不同程度提高，口腔黏膜评分均呈降低趋势，其中高剂量组茅岩莓提取物效果尤为显著，提示适宜剂量的茅岩莓提取物对放射性口腔溃疡具有修复作用。

表1茅岩莓提取物对放射性口腔溃疡大鼠口腔黏膜组织病变评分的影响

图5茅岩莓提取物对放射性口腔溃疡大鼠口腔黏膜组织病变的影响（HE，×100)

在放射性口腔溃疡的发生发展过程中，炎症因子不仅可以直接破坏黏膜组织，还可调节宿主免疫及炎症反应进程，加重炎症反应[21]。TNF-α、IL-6及IL-1β均为介导放射性口腔溃疡的重要介质[22,23,24]。其中TNF-α是常见的促炎症因子，主要由活化的T细胞产生，为黏膜受损时机体最早作出应答的介质之一，可与IL-1β协同触发炎症级联反应，诱导IL-6等多种炎症因子的产生[4,25]。Bossi等[26]研究发现，放疗患者TNF-α、IL-6及IL-1β的唾液水平显著升高，与放射性口腔溃疡严重程度成正相关。本研究结果显示，辐照后模型大鼠的黏膜组织中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均显著提高，结合镜下观察可见口腔黏膜上皮坏死脱落，局部溃疡灶，伴有出血，同时固有层炎症细胞浸润，模型组大鼠病变程度及黏膜组织炎症因子趋势与文献[26]报道基本一致。近年来研究证明茅岩莓及其有效成分二氢杨梅素可以通过抑制TNF-α、IL-6及IL-1β等表达水平，来发挥抗炎作用，改善炎症病变过程[20,27]。本研究发现涂抹金因肽和不同浓度的茅岩莓提取物后大鼠口腔黏膜病变程度明显减轻，金因肽和中、高剂量茅岩莓提取物不同程度地降低组织中IL-6和IL-1β水平，提示适宜剂量的茅岩莓提取物可降低口腔黏膜组织中炎症因子的表达含量。

本研究发现茅岩莓提取物对X射线致大鼠口腔溃疡具有明显抗炎和修复作用，且高剂量作用效果更为明显。有文献报道茅岩莓提取物中有效成分二氢杨梅素可通过抑制NF-κB介导的炎症信号通路减轻动物机体的炎症反应，结合参考文献[27]及本研究结果，我们认为茅岩莓提取物的潜在机制为通过抑制NF-κB的活化来抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达水平，修复口腔黏膜组织，防治放射性口腔溃疡[28,29]。在后续实验中我们将深入探究茅岩莓对放射性口腔溃疡多途径、多靶点抗炎的作用机制，为药物研发、疾病预防和临床指导用药等方面提供参考。

综上所述，通过研究茅岩莓提取物对各组大鼠体征、体重、摄食量、口腔黏膜评分、口腔黏膜细胞因子及口腔黏膜组织病变等指标影响的结果显示，不同剂量的茅岩莓提取物对放射性口腔溃疡均具有修复作用，其作用可能与调节口腔黏膜炎症因子的水平相关。

参考文献:

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基金资助:湖南省重点研发计划项目(No.2020DK2003);

文章来源:唐梓宁,彭冬冬,刘学武等.茅岩莓提取物治疗放射性口腔溃疡的作用研究[J].中南药学,2023,21(09):2311-2316.