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丙氨酸氨基转移酶活性在不同保存条件下的稳定性分析
摘要：目的 分析丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性在各种保存条件下的稳定性。方法 将驻马店市中心血站2022年1月至2023年1月ALT快速检验合格的健康献血者血样(266例)作为研究对象，采集健康献血者抗凝血标本，随即立刻检测ALT初始值，完成上述操作后对血浆实施分离，分别在4℃、25℃、37℃条件下保存，分别检测不同时间ALT活性。结果 ALT在4℃存放72 h内测定值差异无统计学意义(P> 0.05);ALT在25℃下放置24 h测定值差异无统计学意义(P> 0.05),48 h测定值开始发生明显变化，差异有统计学意义(P <0.05);37℃温度下保存12 h其检测值开始发生显著性变化，差异有统计学意义(P <0.05)。结论 ALT活性与保存环境内温度密切相关，为确保血ALT检验结果准确无误，建议血样标本采集后24 h完成检验，如不能即刻检验，应分离血清并低温保存。
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无偿献血临床用血费用直接减免是国家大力推行的一项惠民政策[1]。丙氨酸氨基转移酶(ALT)是人类肝功能的一项诊断指标，目前已成为献血者献血前必须接受的一项血清学检查[2];ALT是一种与人体蛋白新陈代谢明确相关的酶，是常用于评价肝细胞急性损伤的生物标志物[3]。由于ALT主要存在于肝细胞浆内，因此当肝细胞受损时，转移酶非常敏感，很多因素会引起转移酶正常值的上下波动。检验科一般认为ALT最佳、最准确的检验时间为采血后即刻检验，但全国各级中心血站实际工作中对ALT检查往往需历经一个保存过程，在保存期间，温度、时间等相关因素均会对ALT最终检测值稳定性产生影响，因此，采取合理方式保存样本，以此保证ALT检测准确性意义重大[4]。若受检对象血液标本储存不合理，可直接对血液标本的质量、检测结果准确性造成一定影响，从而对献血的可行性及输血治疗的安全性造成一定影响，因此对于真空采血管标本的处理方式非常重要。鉴于此，此次研究筛选出266例ALT快速检验合格的健康献血者血样，对比分析ALT活性在不同保存条件下的稳定性，以减少检测结果误差，确保血液安全以便临床化验人员更好地处理标本，具体分析如下。
1、资料与方法
1.1 一般资料
本次研究经伦理委员会审核通过，将驻马店市中心血站2022年1月至2023年1月ALT快速检验合格的健康献血者血样(266例)作为研究对象。研究样本内的男150例，女116例；年龄22～35岁、平均(27.05±3.01)岁，首次参与无偿献血100例、2次及以上参加者166例。距上一次献血时间已达6个月；献血7 d内未服用任何影响ALT的药物者；所有献血均为自愿献血且对研究知情。排除数据丢失者。
1.2 方法
样本采集：266名献血者均依据以下流程进行采血：(1)用有效碘含量为1.8～2.2 g/L安尔碘消毒。(2)本研究采血均使用一次性真空负压采血器，在献血者采血前需检查负压管是否破损、完好。(3)采取体位为坐位，暴露穿刺部位，在距采血部位6 cm处绑止血带，随后嘱咐患者用力握住拳头。(4)在对静脉实施穿刺前详细询问患者是否存在碘过敏，对于存在碘过敏史的献血者使用75%酒精消毒。(5)随后打开采血袋，检查血袋有无破损，霉点，外包装袋是否完整。确认留样袋内无保养液。关闭采血袋导管上的止流夹，手持针柄，取下护针帽，按照预选的穿刺部位进行穿刺。(6)将带有留样袋端的止流夹打开，血液流入留样袋15～20 m L，关闭留样袋端的止流夹，打开采血主袋端的止流夹，血液流入主采血袋。随后将留样袋下方的一次性真空负压采血针的另一端插入带有献血者信息的真空负压管内，待抽至所需血量后，上下颠倒抗凝管5～8次，充分混匀。
仪器、检验指标及检验方法：检验指标为丙氨酸氨基转移酶(ALT)；全自动生化仪C8000(美国雅培)；方法速率法。使用全自动生化分析仪的单波长速率法分别检测起始值、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h ALT值。采集健康献血者抗凝血标本，随即立刻检测ALT初始值，随后对上层血浆实施离心分离，分别放置在4℃、25℃、37℃条件下保存。每次检验完成闭合盖子，将其置于冰箱、恒温箱内保存。严重高脂蛋白血症、黄疸或溶血血清可能会引起测定管吸光度增高，检验上述血清标本时，需完善血清标本对照。若测定的血清酶活力>150卡门时，则需使用生理盐水对其进行稀释5倍或10倍，稀释完成后再进行检验。添加二硝基苯肼溶液后，需保证其充分混匀(反应完全)，同时需保证添加氢氧化钠溶液的速度保持相同。底物内a-酮戊二酸、二硝基苯肼均为检验过程显色物质，故需保证其称量准确。成批ALT测定时各管加入血清后，试管架应置37℃水浴中操作，以一定的时间间隔各管加入底物缓冲液，每管即时混匀，以加入第一管开始计时，准确每次反应30 min。立即以相同的时间间隔，依次向各管加入2,4-二硝基苯肼，每管即时混合，保证成批ALT测定的准确性。
1.3 观察指标及评价工具
对比不同时间(起始值、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h)、不同温度(4℃、25℃、37℃)下ALT检测结果。
1.4 统计学方法
选择SPSS 22.0软件对研究内全部数据实施计算处理，以%形式表达计数资料，开展χ2检验；以形式表达计量资料，开展t检测(多组间采用F检测)，在P<0.05提示数据差异有统计学分析意义。
2、结果
2.1 不同时间、不同温度下ALT检测结果
ALT在4℃存放72 h内测定值差异无统计学意义(P>0.05);ALT在25℃下放置24 h测定值差异无统计学意义(P>0.05),48 h测定值开始发生明显变化，差异有统计学意义(P<0.05);37℃温度下保存12 h其检测值开始发生显著性变化，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 不同时间、不同温度下ALT检测结果(n=266,
3、讨论
无偿献血血液采集是安全血液的唯一来源,其关系到人类健康和社会发展[5]。丙氨酸氨基转移酶(ALT)是临床实践中用于检测肝功能的重要指标，也是献血者血液筛查的一种非特异性指标，《血站技术操作规程》[6]中明确了ALT在无偿献血者血液安全筛查的意义，若ALT检测值超标，提示供血者可能有传染性肝炎的患病风险，其血液不得用于临床。
在街头无偿献血不具备即刻检验的条件下，往往提取的标本无法及时处理，而标本贮存时间、温度不合适，可导致ALT检测结果出现异常，会使一些ALT轻度升高初期感染肝炎的患者参加献血，造成肝炎经过血液传播，不利临床的用血安全[7,8]。刘朋来等人在其研究[9]中提出ALT检测结果的准确性与血样贮存温度和保存时间有直接关系。张远鹏等人则在其研究[10]中明确提出ALT轻度升高的全血标本经不同的时间和温度后，对ALT活力有一定的影响。
此次研究结果显示：ALT在4℃存放72 h内测定值差异无统计学意义(P>0.05);ALT在25℃下放置24 h测定值差异无统计学意义(P>0.05),48 h测定值开始发生明显变化，差异有统计学意义(P<0.05);37℃温度下保存12 h其检测值开始发生显著性变化，差异有统计学意义(P<0.05)。相关分析如下：ALT属于“酶”类物质，酶是能促使人体化学反应的一类特殊蛋白质[11]。酶产生于人体不同组织，体液中酶的浓度反映相应组织或器官的生理病理状态，因而可用于临床诊断[12]。通常，血清/血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性被作为肝脏损伤的指标。然而，酶活性测定的结果会受到分析前因素的影响，如血液标本在采血和分析时的保存、储存或处理方法不当，可能导致错误的诊断结果[13,14]。
酶对化学反应的催化效率称为酶活性，酶活性的高低可以用在一定条件下，酶所催化的某一化学反应的反应速度来表示[15]。若血样标本存放温度的过高，则血样内部的细胞内酶释放明显加速，酶活性明显增强，血葡萄糖酵解速度明显增快[16]；血葡萄糖快速酵解过程中，会持续的产生丙酮酸，该物质作为ALT检测反应中的中间产物其值的高低直接影响着ALT的结果[17,18]。上述相互间的影响机制与物质的各种键相互作用、温度相关的焓、熵变化明确相关。具体可表现为恒定的稳定范围内保持酶自身热稳定性与自身结构稳定性[19,20]；温度会通过影响酶活性位点的亲和力影响酶的活性，因此，在不同温度下ALT活性对比呈现明显差异[21]。本研究结果显示，在血样保存24 h内，4℃、25℃保存时间内不会对ALT活性造成明确影响，可作为ALT首先保存条件[22]。相关研究提出ALT检测值随着贮存时间的延长而下降，贮藏时间越长，下降越明显[23]；在25℃、37℃温度保存条件下，温度越高、时间越长，则对ALT的检测结果影响越大，原因在于葡萄糖酵解过程中会产生大量丙酮酸，而丙酮酸是ALT检测反应的一种中间产物，对ALT检测结果具有直接影响，另外伴随温度的升高与保存时间的延长，红细胞被破坏的数量逐渐增加，红细胞内ALT释放到血清中导致了ALT的升高[24]。一般而言，较高温度下酶的降解会更快，而低温(4℃)则会使酶的活性保持更长时间，但需要注意标本冷冻保存的时间不宜过长，如需要长时间保存需要提前做好稳定性验证，以确定最佳的保存时间。因此，在实际操作中，应根据具体酶的特性和实验需求，选择合适的存储条件，以保证测定结果的准确性和可靠性。
本研究的样本采用方便取样，仅收取了466份血样为研究对象，可能存在一定的选择偏倚，研究结果准确性并不稳定，值得后续研究继续优化，最大程度提升结果的准确性。
综上所述，丙氨酸氨基转移酶活性受保存条件影响，建议短期保存血浆采用4℃，在72 h内ALT活性是比较稳定的，在实际应用中应根据检验样本的需求合理选择保存条件，以此提升检测结果的准确性，确保血液安全。
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文章来源:王静,李刚,张莉.丙氨酸氨基转移酶活性在不同保存条件下的稳定性分析[J].临床研究,2024,32(05):142-144.
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