精液保存质量是影响人工授精的重要因素,保存方式有液态保存和固态保存,而液态保存又分为常温保存和低温保存[1]｡ 常温保存温度为15 ~ 25℃,相较于低温和冷冻保存,具有操作简单､ 条件要求低､便于运输､ 精液品质高和授精效果好等优势[2]｡ 常温保存的精液随着时间延长会产生大量的活性氧(ROS),当ROS超过精子自身抗氧化能力时,不仅使精子产生脂质过氧化反应(LPO),还可降低其活力和质膜完整率,导致精液品质下降[3-4]｡ 因此在精液保存过程中有必要添加一定量的抗氧化剂以降低精子产生的ROS,减缓氧化反应,提高精液常温保存质量[5]｡表儿茶素(EC)是一种黄烷醇类化合物｡ 白色晶体,易溶于水,在茶叶､ 浆果等植物中含量较为丰富,其抗氧化性能主要通过两种机制发挥作用,一是直接与金属离子发生反应;二是通过促进抗氧化酶活性增强其对自由基的清除能力,间接发挥抗氧化性能[6]｡ 已有研究表明,添加50 ~ 100 μmol / L EC到牛精液稀释液中有助于更好地保持精子活力,并显著提高精液的抗氧化能力[7]｡ 另外,在猪精液稀释液中添加不同浓度的EC能够改善精子质量,并可缓解精液中的LPO反应[8];此外, EC衍生物已被证实能够提高小鼠胚胎的受精率[9],但其在绵羊精液常温保存方面的影响尚未有相关报道｡ 本试验以多浪羊精液作为试验对象,探讨在常温保存下添加不同浓度EC并分析其对精液常温保存效果的影响,为提高良种公羊在精液保存方面的研究提供参考依据｡

1、材料与方法

1. 1试验动物及精液采集

试验在新疆芳草湖万只肉羊繁育场进行,选择年龄3岁､ 体况中等､ 性欲旺盛并无生殖疾病的3只多浪公羊,假阴道法采集精液,取精子活力75%以上,精子密度1 × 109个/ mL以上的精液进行混合,共3 mL,置于室温保存,以备在保存0､12､24､36､48､60和72 h后检测绵羊精液品质,同时在保存24､48､72 h后检验精子超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的变化,对精液品质进行评定｡

1. 2试剂与设备

EC购自源叶生物公司; 4%多聚甲醛､ 吉姆萨原液､ 柠檬酸三纳､ 乳糖､ 三羟甲基氨基甲烷( Tris)均购自北京索莱宝生物科技有限公司; CAT与SOD试剂盒购自北京盒子生工科技有限公司;迈朗精子全自动分析系统CASA购自松景天伦有限公司(型号为ML-210LZ)｡

1. 3稀释液的配制以及精液的稀释和保存

在15~25℃ 室温环境下,准确称取Tris 3. 07 g,柠檬酸1. 63 g,葡萄糖1. 00 g,乳糖1. 00 g溶解于100 mL灭菌超纯水中｡ 新鲜鸡蛋剥开外壳,去除卵黄表面的蛋清,注射器针头挑破卵黄,用无针头注射器吸取卵黄液,按照10%的比例注入溶液中,再加入青霉素和链霉素各10 000 U,最后使用搅拌器搅拌30 min充分混匀,配制成稀释液,然后在稀释液的基础上每组分别添加不同浓度EC,配制成0 ~ 600μmol / L的常温保存稀释液,经过预试验最终确定试验浓度为0､250､300､375､450､600 μmol / L的EC抗氧化剂作为常温保存稀释液｡将已配制好的常温稀释液水浴升温至37℃ ｡ 采用9∶1的比例,缓慢地将稀释液加入等温的精液中,边加入边搅拌均匀,稀释后总体积为30 mL｡ 然后迅速将混合物分装至1. 5 mL的离心管中,并使其冷却至室温｡ 试验分为6组,每组使用5份样品,每份样品体积为0. 5 mL,每个试验重复3次｡ 检测精液品质和抗氧化指标分别使用15 mL｡ 随后,将离心管用多层棉花包裹,放置于温度为17℃ 的恒温箱中｡ 为了避免精子的聚沉,每隔12 h需缓慢地摇动离心管｡

1. 4精液品质检测指标及方法

精子 活 率､ 活 力 使 用 计 算 机 辅 助 精 子 分 析(CASA)检测:取适量稀释后的精液于1. 5 mL离心管中, 37℃水浴5 min,在显微镜下随机观察5个视野,且每次计数不少于200个精子,重复3次｡ 精子活率=存活精子数/总精子数×100%,精子活力=向前直线运动的精子数/总精子数×100%｡精子质膜完整率采用低渗肿胀试验[10]进行测试:取1 mL HOST液和离心管, 37℃预热5 min,预热好的精液10 μL放入离心管,再加入100 μL HOST液混匀｡37℃水浴锅孵育45 min｡ 倒置荧光显微镜下随机观察5个视野,计数200个以上,记录弯尾精子数｡ 质膜完整率=弯尾精子数/总精子数×100%｡精子顶体完整率测定:将10 μL预热好的精液样品滴加在载玻片上,等待玻片干燥后使用多聚甲醛固定10 min,后使用吉姆萨染液染色80 min,用1×PBS液缓慢冲洗玻片,尽量洗去浮色,后置于黑暗试验台上待其自然干燥,盖好盖玻片,在荧光倒置显微镜下镜检至少200个精子进行随机计数,且重复5次以上,以确定精子顶体的完整率｡ 顶体完整率=顶体完整的精子数/总精子数×100%｡抗氧化能力测定:采用相应的试剂盒分别在保存24､48和72 h后对精液中CAT和SOD活性进行检测｡

1. 5数据统计与分析

使用Excel 2021软件统计整理数据,然后使用SPSS 19. 0软件对试验所得各指标数据进行双因素方差分析和Duncan多重检验｡ 结果以 “平均值±标准差” 表示, P<0. 05代表差异显著｡

2、结果与分析

2. 1不同浓度EC对常温保存的精子活力的影响

由图1所示,通过添加不同浓度的EC,可以改善常温保存24 h以上的精子活力｡ 在精子保存24 h时, 375 μmol / L试验组的精子活力显著高于其他各组(P<0. 05), 300 μmol / L试验组显著高于对照组和250､450和600 μmol / L试验组(P<0. 05); 36 h时, 375 μmol / L试 验 组 显 著 高 于 其 他 各 组( P <0. 05), 450 μmol / L试验组显著高于对照组和250､300､600 μmol / L试验组(P < 0. 05); 48 h时, 375μmol / L试验组精显著高于其他各组(P<0. 05), 300μmol / L试验 组 显 著 高 于 对 照 组 和250､450､600μmol / L试验组(P<0. 05); 60 h时, 375 μmol / L试验组显著高于其他各组( P < 0. 05); 72 h时, 375μmol / L试验组显著高于其他各组(P<0. 05)｡同时间数据之间比较,标注不同小写字母表示差异显著( P <0. 05);同组数据之间比较,标注不同大写字母表示差异显著( P<0. 05)｡ 彩色字母对应相应组别标注,黑色字母为其余组共同标注｡下同

｡图1不同浓度EC对绵羊精子活力的影响

2. 2不同浓度EC对常温保存的精子活率的影响

由图2所示,精子保存24 h时, 375 μmol / L试验组精子活率显著高于其他各组( P < 0. 05), 300μmol / L试验组显著高于对照组､450和600 μmol / L试验组(P<0. 05); 36和48 h时, 375 μmol / L试验组显 著 高 于 其 他 各 组( P < 0. 05 ); 60 h时, 375μmol / L试验组显著高于对照组､250､450和600μmol / L试验组(P<0. 05); 72 h时, 375 μmol / L试验组精子活率为64. 68%,显著高于其他各组( P <0. 05)｡

2. 3不同浓度EC对常温保存的精子质膜完整率的影响由

图3所示,精子保存24 ~ 72 h时,含有375μmol / L EC的试验组质膜完整率显著高于其他各组(P<0. 05); 48 h时, 300 μmol / L试验组质膜完整率为63. 20%,显著高于对照组和250､450､600 μmol / L试验组(P<0. 05); 72 h时, 300 μmol / L试验组质膜完 整 率 为62. 20%,显 著 高 于250､450和600μmol / L试验组(P<0. 05)｡

2. 4不同浓度EC对常温保存的精子顶体完整率的影响

由图4所示,精子保存在24 ~ 72 h时, 375μmol / L试验组顶体完整率显著高于其他各组( P <0. 05); 48 h时, 250､300和450 μmol / L试验组顶体完整率显著高于对照组和600 μmol / L试验组(P<0. 05); 72 h时, 300和450 μmol / L试验组顶体完整率显著高于对照组和250､600 μmol / L试验组(P>0. 05)｡

图2不同浓度EC对绵羊精子活率的影响

图3不同浓度EC对绵羊精子质膜完整率的影响

图4不同浓度EC对绵羊精子顶体完整率的影响

2. 5不同浓度EC对常温保存的绵羊精子CAT活性的影响由

图5所示,精子保存24和48 h时, 375 μmol / L试验组的CAT活性显著高于其他各组(P < 0. 05),保存72 h时对照组显著低于各试验组(P < 0. 05)｡除此,在保存24 h时,对照组显著低于250､300和450 μmol / L试验组(P<0. 05); 48 h时, 450 μmol / L试验组显著高于对照组(P<0. 05)而与250､300和600 μmol / L差异不显著( P > 0. 05); 72 h时, 375μmol / L试验组CAT活性最高, 375和450 μmol / L试验组显著高于其他各组(P<0. 05), 250､300和600μmol / L试验组之间差异不显著(P>0. 05)｡

图5不同浓度EC对常温保存绵羊精子CAT酶活性的影响

2. 6不同浓度EC对常温保存的绵羊精子SOD活性的影响由图6所示,精子保存72 h内, 375 μmol / L试验组的SOD活性显著高于其他各组,保存48和72 h时对照组显著低于各试验组(P<0. 05)｡图6不同浓度EC对常温保存绵羊精子SOD酶活性的影响除此,在进行保存24 h时,对照组显著低于250和450 μmol / L试 验 组( P < 0. 05),与300和600μmol / L试验组差异不显著( P > 0. 05);保存48 h时, 300 μmol / L试验组显著高于对照组和250､450､600 μmol / L试验组( P < 0. 05);保存72 h时, 450μmol / L试验组SOD酶活性显著高于对照组和250､300､600 μmol / L试验组(P<0. 05)｡

3、讨论

3. 1 EC对常温保存绵羊精液品质的影响

精液的品质在受精过程中发挥着重要的作用,不仅可预测精子的受精能力,还是精子成功穿卵完成受精的前提[11]｡ 而在精液保存过程中,不可避免会受到ROS的影响,使精液受精能力下降｡ 本研究中添加适宜浓度的EC可缓解绵羊精液常温保存过程中的氧化损伤,提升精液保存质量,这一结果与Tvrda等[7]在牛冷冻精液的研究结果一致｡ 本试验结果显示,在绵羊精液常温保存稀释液中添加EC,在12 h后各试验组的精子品质均有显著提升,其中375μmol / L试验组的效果最佳,保存24 h时精子活力达到89. 33%,与张凤等[12]在稀释液中添加白藜芦醇的结果相似(90. 07%),而精子活率为94. 07%,与郝文等[13]的试验结果相似,且显著高于李智星等[14]所得出的研究成果｡ 另外,根据褚长江等[15]的研究发现,在保存24 h时精子活力､ 活率分别达到93. 39%和96. 64%,显著高于本试验相同时间下的研究成果(89. 33%､94. 07%),分析原因主要是添加剂的成分､ 浓度不同而导致的｡375 μmol / L试验组的质膜完整率和顶体完整率也有显著提升,其中质膜完整率在保存24 h时, 375 μmol / L试验组达到75. 87%,显著高于在稀释液中添加2%的甘油(65. 48%)的结果[16]｡ 在相同保存时间内375 μmol / L试验组顶体完整率与张凌蛟等[17]所得出的研究结果相似｡ 以上结果都表明,在常温保存稀释液中添加EC对精子结构完整性有显著提升,且质量浓度为375 μmol / L效果最佳｡

3. 2 EC对常温保存精液抗氧化能力的影响

精液在常温保存期间产生的ROS会诱导精子细胞膜发生LPO,这改变了细胞膜的通透性和流动性,并对精子产生不良反应[18],故必须加入外源抗氧化剂来降低精子所受到的损伤｡ 哺乳动物精浆抗氧化系统中SOD和CAT是重要组成部分,两者相互配合可清除ROS,抑制自由基,防止LPO堆积[19],因此精子的抗氧化能力与SOD与CAT的活性有密不可分的关系,研究发现通过在绵羊稀释液中添加SOD (800U/ mL-1)和CAT (200 U/ mL-1),可以有效增强精子的抗氧化能力,使得体外受精率增长15%,精液储存率提高25%,有效减缓ROS生成及精子结构的氧化损伤[20-21]｡ 本试验在24､48､72 h分别测定SOD与CAT活性,结果表明,在精液稀释液中添加EC能够显著提高精液抗氧化酶CAT与SOD的活性,这与Venkatakrishnan等[22]在人类研究中的结果一致｡ 抗氧化酶活性都随着EC浓度的提高表现为先上升再下降的趋势,与张柳明[23]､ 贺巾津[24]所研究结果相一致,这可能是由于添加剂浓度过高导致ROS含量过低引起,因为适当的ROS含量是精子代谢所必需的,它对于维持胞膜的流动性具有关键作用,添加剂浓度过高可能会抑制ROS的生成,从而影响精子的代谢过程和细胞膜的流动性｡ 在375 μmol / L的添加浓度下, SOD与CAT活力均为最高,提升最显著,可能是因为添加375 μmol / L的EC时,对抗LPO的能力最强,其增强抗氧化酶活力的程度最高,另一方面,由于精子质膜上富含PUFA,其质膜的结构可能会随着EC浓度的提高而发生变化,从而降低了质膜通透性,使各指标降低[25]｡ 另外, EC还能够通过抑制还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶等的活性来间接地清除自由基,提高精子的总抗氧化能力[26]｡ 因此,本研究发现在精液常温保存中添加375 μmol / L EC能够显著提升精液抗氧化能力｡

综上,在常温保存绵羊精液中加入375 μmol / LEC可以更好改善精子活力､ 活率､ 精子质膜完整率和顶体完整率,同时还提高了精子SOD､CAT的活性,改善了精液抗氧化能力｡

参考文献:

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基金资助:兵团财政科技计划项目-重点领域科技攻关计划(2021AB014);

文章来源:李栩,郭艳昭,洪道辉,等.表儿茶素对多浪羊精液常温保存效果的影响[J].畜牧与兽医,2025,57(02):9-13.