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羊泰勒虫可视化LAMP检测方法的建立

2023-10-30 66 上传者：管理员

摘要：为了建立1种快速简便的羊泰勒虫检测方法，试验根据羊泰勒虫MPSP基因设计2组引物，建立羊泰勒虫环介导等温扩增(LAMP)检测方法，利用该方法分别检测羊泰勒虫、瑟氏泰勒虫、卵形巴贝斯虫、附红细胞体的DNA。结果：LAMP方法检测羊泰勒虫的结果为阳性，其他虫体均为阴性，具有较好的特异性；对羊泰勒虫DNA最低检测量为1.9×10-9 ng/μL,是PCR方法的100倍。分别利用LAMP、PCR检测30份疑似羊泰勒虫感染病例，LAMP方法阳性检出率为20%(6/30),PCR方法阳性检出率为16.67%(5/30),LAMP方法准确率高于PCR方法。结论：建立的羊泰勒虫可视化LAMP检测方法特异性好、准确率高，可作为羊泰勒虫病诊断的检测方法。

关键词：
MPSP基因
准确率
特异性
环介导等温扩增技术
羊泰勒虫
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羊泰勒虫(Theileria)是1种经蜱传播的血液原虫[1]。羊感染后主要表现消瘦、被毛无光泽，吉林本地羊感染多表现为带虫免疫，无明显症状，外地引进羊感染症状较明显[2,3]。羊泰勒虫病呈世界性分布，日本、韩国等多个国家有流行报道，我国新疆、山东、青海、甘肃、四川、吉林等省(区)也有相关报道[4,5,6,7]。目前尚未研制出有效的疫苗进行预防，早期诊断对该病的预防有重要意义。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method, LAMP)操作简单，只需水浴锅就可实现可视化检测，适用于基层检测诊断。本试验对羊泰勒虫吉林株MPSP基因进行克隆，建立LAMP可视化检测方法，为羊泰勒虫病的诊断提供1种新的检测技术。

1、材料与方法

1.1 检测样品

采集吉林省珲春市某牧场放牧绵羊抗凝血样品30份用于LAMP方法验证试验；附红细胞体阳性DNA、瑟氏泰勒虫阳性DNA、卵形巴贝斯虫阳性DNA由本实验室保存；羊泰勒虫阳性DNA由本实验室分离保存[8]。

1.2 主要试剂和仪器

血液基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、质粒小提试剂盒(均购自天根生化科技有限公司),Bst DNA Polymerase、SYBR GreenⅠ、DNA Marker(均购自生工生物工程股份有限公司),TaKaRa TaqTM(购自宝日医生物技术有限公司)。高速低温离心机(型号：Eppendorf 5810R,德国艾本德股份公司)、PCR仪(型号：TC1000-S,大龙兴创实验仪器有限公司)、电泳仪(型号：DYCP-31DN,北京六一生物科技有限公司)、数字凝胶成像分析系统(型号：JS-680D,上海培清科技有限公司)

1.3 引物

根据GenBank中羊泰勒虫MPSP基因序列(登录号：GQ281044),利用在线软件Primer 3(https: //github.com/primer3-org/primer3)设计1对引物(P1:5’-CTTTGCCTAGGATACTTCCT-3’;P2:5’-ACGG CAAGTCAAGTGGTGAGAACT-3’),用于扩增羊泰勒虫吉林株MPSP基因，预扩增长度776 bp。以羊泰勒虫吉林株MPSP基因为参照序列，应用在线软件 LAMP primer designing software(http: //PrimerExplorer)设计LAMP内、外2对引物(FIP:5’-TGGAGGC ATCGAGGTCTTTGGAAGTTCAGCTTCGCCCAGTA-3’,BIP:5’-GCTGGTCTTTTTGCCCCTGATGACCTTGAA GTTTCCGACGAA-3’;F3:5’-GAGCGACAAGGAA TGGGTAC-3’,B3: 5’-CCTCGAACTTGACCTTGGTG -3’)。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.4 羊泰勒虫MPSP基因的克隆及测序

按照血液基因组DNA提取试剂盒(DP348)说明书方法提取羊泰勒虫DNA。以此为模板进行羊泰勒虫吉林株MPSP基因的PCR扩增。PCR反应体系25 μL:DNA 2.0 μL,dNTPs mixture 2.0 μL,缓冲液buffer 2.5 μL,Taq酶0.125 μL,上、下游引物各0.5 μL,ddH2O 17.375 μL。PCR反应条件：95 ℃ 4 min; 94 ℃ 45 s, 58 ℃退火55 s, 35个循环；72 ℃延伸 7 min。 PCR阳性产物送往吉林省库美生物科技有限公司测序。

1.5 LAMP反应体系的优化与可视化检测

LAMP反应体系25 μL:羊泰勒虫阳性标准DNA 2 μL,dNTPs(10 mmol/L)3.5 μL,MgSO4(100 mmol/L)1.5 μL,Bst DNAPolymerase 1 μL,10×Bst buffer 2.5 μL,FIP、BIP各2 μL,F3、B3各0.25 μL,ddH2O 10 μL。反应条件：63 ℃退火50 min, 80 ℃,5 min后置于冰上终止反应，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。对以上LAMP反应体系的反应时间梯度(30、40、50、60 min)、反应退火温度梯度(59、61、63、65 ℃)、外引物和内引物浓度梯度(1∶2、1∶4、1∶8、1∶10)、Mg2+ 浓度梯度(10、8、6、4 mmol/L)进行优化，筛选最佳组合反应条件。反应结束后向LAMP产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ 1 μL,观察结果。

1.6 LAMP方法的特异性验证

用建立的LAMP方法分别扩增瑟氏泰勒虫、卵形巴贝斯虫、附红细胞体、羊泰勒虫的DNA,以验证该方法的特异性。

1.7 LAMP方法的敏感性验证

测定并倍比稀释羊泰勒虫DNA含量，以各稀释度的DNA为模板，分别进行LAMP和PCR扩增，以验证该方法的敏感性。

1.8 LAMP方法的临床验证

分别以LAMP方法和PCR方法对30份疑似羊泰勒虫感染的羊血液进行检测，以验证该方法的准确性。

2、结果与分析

2.1 羊泰勒虫吉林株MPSP基因的PCR扩增

通过对绵羊抗凝血DNA进行PCR扩增，扩增产物长度约776 bp, 与预期结果一致(见图1)。测序结果分析显示与羊泰勒虫DNA序列(GQ281044)同源性为99.8%。

图1 羊泰勒虫吉林株MPSP基因的PCR扩增

2.2 LAMP反应条件的优化

退火温度为61 ℃(见图2),反应时间为40 min(见图3),Mg2+ 浓度为6 mmol/L(见图4),反应梯状条带最清晰，效果最佳。

图2 LAMP反应温度的优化

图3 LAMP反应时间的优化

图4 LAMP反应Mg2+浓度条件的优化

2.3 LAMP可视化检测

按优化条件对阴性、阳性样品进行LAMP检测，反应液管中加入SYBR GreenⅠ后，可直接观察反应结果。阳性样品3、4号反应管的液体颜色变为绿色荧光；阴性样品1、2号反应管的液体颜色无变化；空白对照5号反应管的液体也无颜色变化(见图5)。

图5 羊泰勒虫LAMP可视化检测

2.4 LAMP特异性

由图6、图7可见：LAMP检测仅羊泰勒虫DNA扩增出特异条带，其他虫体均无特异条带，羊泰勒虫LAMP具有良好的特异性，LAMP可视化检测结果与电泳检测结果一致。

图6 羊泰勒虫LAMP的特异性检验

图7 羊泰勒虫特异性可视化检验

2.5 LAMP敏感性

由图8、图9可见：羊泰勒虫的PCR方法最低检测量为1.9×10-7 ng/μL,LAMP方法最低检测量为1.9×10-9 ng/μL,LAMP方法的最低检测量是PCR的100倍。

图8 不同浓度羊泰勒虫DNA的PCR检测

图9 不同浓度羊泰勒虫DNA的LAMP检测

2.6 LAMP临床验证

对30份疑似羊泰勒虫感染羊血液检测结果显示，LAMP检测阳性检出率为20%(6/30),PCR检测阳性检出率为16.67%(5/30),LAMP方法准确率高于PCR方法。

3、结论

试验成功建立了羊泰勒虫可视化LAMP检测方法，特异性好、准确率高，可作为羊泰勒虫病诊断的检测方法。

4、讨论

羊泰勒虫病给养羊业造成的经济损失很大，尤其羔羊的死亡率较高，目前尚无特效治疗措施[9]。因此，羊泰勒虫病的早期诊断对该病的防治有重要意义。血涂片镜检曾是国内主要采用的羊泰勒虫病诊断方法，但该方法不适合进行早期诊断。随着分子生物学技术的发展，相继出现了羊泰勒虫PCR、套式PCR、荧光定量PCR等分子生物学检测方法，为羊泰勒虫病的诊断提供了新的途径[10,11,12]。PCR方法需要较昂贵的PCR仪，不适合基层检测。MPSP基因具有介导病原黏附和侵染宿主细胞的作用，有较好的保守性，常用作分子诊断的靶基因[13]。本试验在羊泰勒虫吉林株MPSP基因测序的基础上，建立了LAMP可视化检测方法，特异性好，敏感性优于PCR方法，可实现对羊泰勒虫病的早期检测，经济、方便，适用于基层开展羊泰勒虫病诊断。

参考文献:

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