山羊(Capra hircus)乳及其产品因营养价值高、易消化吸收、抗过敏等特点备受消费者青睐。羊奶富含短中链脂肪酸及不饱和脂肪酸等有益脂肪酸，是其具有特殊营养价值及保健功能的主要原因(Haenlein,2004;Liu et al.,2021)。有研究者利用组蛋白H3K27ac染色质免疫共沉淀测序(chromatin immunoprecipitation sequencing,CHIP-seq)，在奶山羊乳腺组织中筛选出调控脂肪酸代谢的关键转录因子—叉头框蛋白O1 (forkhead box protein O1,Fox O1)，发现Fox O1可抑制乳腺上皮细胞中脂肪酸从头合成基因的表达，进而抑制甘油三酯合成，最终改变细胞内的脂肪酸含量(He et al.,2020)。目前，转录因子Fox O1影响乳腺脂肪酸组成和含量的调控机制仍不清楚，揭示Fox O1在脂肪酸代谢中的调控机制将有助于改善羊奶成分及品质。

Fox O1作为哺乳动物体内重要的核转录因子，是胰岛素信号通路的重要中介，参与细胞生长和代谢等多种生物学过程(Haeusler,Domenico,2008;Ponugoti et al.,2012)，特别是调节肝脏糖异生和甘油三酯稳态(Dong,2017)。研究表明，过表达Fox O1可上调脂肪酸转运相关基因及脂解基因的表达量，从而抑制脂质积累，减少肝脏中甘油三酯的含量(Ono et al.,2003;Zhao et al.,2021)；敲除Fox O1可显著增加肝脏内胆固醇的含量(Haeusler et al.,2010)。胆固醇调节元件结合蛋白1 (sterolregulatory element binding protein 1,SREBP1)是脂肪酸代谢过程中重要的转录调控因子(Hishikawa et al.,2020),Fox O1通过结合在SREBP1启动子的特异性蛋白1 (specificity protein 1,Sp1)和固醇调节元件(sterol regulatory element,SRE)位点而抑制SREBP1基因的转录活性，导致脂肪酸从头合成相关基因的表达量显著下调(Deng et al.,2012;Jang et al.,2016)。在小鼠(Mus musculus)胚胎成纤维细胞3T3-L1中，Fox O1通过与甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)基因启动子结合，激活AT-GL基因转录，减少脂肪细胞中甘油三酯的积累(Chakrabarti,Kandror,2009;Zhang et al.,2016)。Fox O1在脂肪酸代谢过程中有重要的调控作用，但影响乳腺脂肪酸组成的机制尚不完全清楚。因此，本研究在克隆得到Fox O1基因启动子的基础上，拟利用重叠延伸PCR方法构建Fox O1结合位点突变的荧光素酶报告基因载体，通过荧光素酶活性确定启动子的表达活性；在奶山羊乳腺上皮细胞中，分析Fox O1过表达、敲低以及Fox O1结合位点突变对Fox O1启动子活性的影响，为揭示Fox O1基因的转录调控机制提供基础资料。

1、材料与方法

1.1 实验动物与试剂

选用5只年龄和体重相似的西农萨能奶山羊(Capra hircus)，颈静脉采血8 m L，用于基因组DNA提取。

基因组提取试剂盒购自全式金公司(北京)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega (美国)；大肠杆菌(Escherichia coli) Top10感受态细胞、DNA回收试剂盒、质粒高纯提取试剂盒及DNA分子标量购自北京天根生化科技有限公司；T4连接酶和限制性内切酶购自NEB (美国)；Prime STAR HS高保真酶购自Ta Ka Ra (日本)；DMEM/F-12培养基、标准胎牛血清及表皮因子购自Invitrogen (美国)；X-treme GENE HP转染试剂购自Roche (瑞士)；青霉素和链霉素购自哈尔滨制药公司；胰岛素、氢化可的松购自Sigma (美国)；萤火虫荧光素酶报告基因载体p GL3-Basic与海肾荧光素酶对照报告基因载体p RL-TK由本实验室保存。

缺失片段重组载体和重叠延伸PCR中的引物利用Primer Premier 5.0设计，由北京擎科公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取

将采集的奶山羊血液利用试剂盒提取基因组DNA。利用分光光度计Nanodrop 8000 (Thermo,美国)检测DNA浓度和纯度。

1.2.2 Fox O1过表达载体构建

根据NCBI山羊基因组克隆得到Fox O1序列，然后与pc DNA3.1载体经限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ在37℃酶切过夜。利用DNA回收试剂盒回收酶切产物，经T4连接酶连接，回收连接产物pc D‐NA3.1-Fox O1并转化TOP10感受态细胞，挑取单克隆扩繁培养。提取质粒后送北京擎科公司测序。

1.2.3 Fox O1启动子克隆

根据NCBI上的山羊基因组序列，利用Primer Premier 5.0设计奶山羊Fox O1基因启动子的上下游引物(表1)。以奶山羊全血基因组DNA为模板克隆得到Fox O1启动子序列，PCR反应程序和体系按照赫秋亚等(2016)的方法。PCR产物进行电泳检测，目的条带经切胶回收后连接p MD19-T载体，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑取阳性质粒p MD19-T-Fox O1送北京擎科公司测序。利用PATCH public 1.0 )和JASPAR database 数据库预测Fox O1启动子序列上的转录因子结合位点。

1.2.4 Fox O1缺失片段重组载体的构建

根据生物信息学分析结果，分别在Fox O1启动子-861、-391、-297、-207、-95、-24 bp设计PCR上游引物(表1)，下游引物为克隆引物，分别在上下游引物的5'端添加MiuⅠ和HindⅢ酶切位点。以p MD19-T-Fox O1质粒为模板进行扩增，PCR反应体系：2×GC bufferⅡ(Mg2+) 10μL,100μmol/L d NTPs2μL,LA Taq 0.2μL,10μmol/L上下游引物各1μL,DNA模板0.1μL,H2O 5.7μL。PCR程序：95℃变性3 min;94℃30 s,55℃30 s，缺失片段由长至短分别在72℃延伸80、40、30、25、20和15 s,34个循环；72℃终延伸10 min,4℃保存。扩增产物经MiuⅠ和HindⅢ双酶切后连接同样被酶切的p GL3-basic载体，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑取缺失片段的阳性质粒送北京擎科公司测序。  

表1 引物信息  

1.2.5 Fox O1启动子定点突变载体的构建

经生物信息学预测，在Fox O1启动子上存在2个Fox O1结合位点。参照赫秋亚等(2016)的方法，通过重叠延伸PCR获得2个结合位点FKH1 (fork‐head transcription factor 1)和FKH2的定点突变体。对于单个FKH位点突变启动子，首先以p GL-basicFox O1 (-1301～+200 bp)为模板，克隆上游片段时上游引物为Forward，下游引物为FKH1-anti-mut或FKH2-anti-mut；克隆下游片段时上游引物为FKH1-mut或FKH2-mut，下游引物为Reverse (表1)。PCR反应体系：2×GC bufferⅡ(Mg2+) 10μL,100μmol/L d NTPs 2μL,LA Taq 0.2μL,10μmol/L上下游引物各1μL,DNA模板0.3μL,H2O 5.5μL。PCR程序：95℃变性3 min;94℃30 s,57℃30 s,72℃1 min,34个循环；72℃延伸10 min,4℃保存。在进行第2轮PCR时，按照上下游片段质量比为1∶1的比例添加模板质粒，上游引物为Forward，下游引物为Re‐verse (表1)。对于FKH双突变启动子，以FKH1位点突变启动子(p GL-basic-FKH1-mut)为模板，按照上述PCR方法，克隆上游片段时上游引物为For‐ward、下游引物为FKH2-anti-mut，克隆下游片段时上游引物为FKH2-mut、下游引物为Reverse (表1)，获得FKH1和FKH2位点同时突变的产物；重组PCR片段经MiuⅠ和HindⅢ酶切，连接到p GL3-ba‐sic载体上，生成突变体p GL-basic-FKH1/2-mut，交由奥科公司(西安)测序，验证序列的准确性。

1.2.6 细胞培养

按照本实验室建立的方法分离和培养山羊乳腺上皮细胞(goat mammary epithelial cell,GMEC)(Zhu et al.,2015;He et al.,2021)，并进行纯化和鉴定(Wang et al.,2010;Shi et al.,2014)。培养基含90%基础DMEM/F12培养基、10%胎牛血清、5 mg/L牛胰岛素、5μg/m L氢化可的松、100 U/m L青链霉素和10 ng/m L表皮生长因子。细胞培养于5%CO2、37℃培养箱，实验前48 h加入2 mg/L催乳素。

1.2.7 细胞转染及荧光素酶活性检测

将GMEC接种于48孔板并培养过夜，待细胞浓度达到80%～90%，利用X-treme GENE HP DNA转染试剂将重组质粒p GL3-basic-Fox O1、不同片段缺失载体p GL3-basic-Fox O1-861/391/297/207/95/24、p GL3-basic-FKH1-mut、p GL3-basic-FKH2-mut以及p GL3-basic-FKH1/2-mut质粒分别转入细胞，转染试剂与质粒的比例为1∶3，每孔转染质粒总量为300 ng。以海肾荧光素酶表达质粒p RL-TK为对照，p GL-basic-Fox O1与p RL-TK的比例为50∶1。在过表达实验中，过表达载体pc DNA3.1-Fox O1与不同片段缺失的启动子载体共转染乳腺上皮细胞；在敲低实验中，先将si FOXO1转染乳腺上皮细胞，12 h后将不同片段缺失的启动子载体转染细胞，48 h后收集细胞并裂解。上述样品按照试剂盒说明书的方法进行荧光素酶活性检测。si FOXO1序列如下：

Sense:5'-GCAUGUUUAUCGAGCGCUUTT-3';

Antisense:5'-AAGCGCUCGAUAAACAUGCTT-3'。

1.2.8 数据统计

所有实验设置3个生物学重复，每个生物学重复设置3个技术重复。实验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0软件进行Student's t检验统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果与分析

2.1 西农萨能奶山羊Fox O1基因启动子的克隆与活性检测

以奶山羊全血DNA为模板，克隆得到Fox O1基因5'侧翼序列1 500 bp (图1A)。将该序列构建双荧光素酶报告载体p GL3-basic-Fox O1，转染乳腺上皮细胞，48 h后检测双荧光素酶活性，结果显示，Fox O1启动子报告载体的酶活性显著高于对照(P<0.01)，提示Fox O1启动子具有显著的转录活性(图1B)。

2.2 Fox O1基因启动子活性区域鉴定

为进一步确定Fox O1启动子的活性区域，设计7对不同长度的缺失引物，以Fox O1启动子的全长片段为模板，扩增得到-1 301～+200 bp、-861～+200 bp、-391～+200 bp、-297～+200 bp、-207～+200 bp、-95～+200 bp和-24～+200 bp不同区域的DNA片段(图2)。经MiuⅠ和HindⅢ酶切后连接荧光素酶报告基因载体p GL3-basic，挑选单克隆质粒进行测序。

将测序正确的Fox O1启动子不同片段重组载体与海肾荧光素酶对照报告基因载体(p RT-TK)共同转染GMEC,48 h后检测双荧光素酶活性。结果表明，不同长度的Fox O1启动子与空载体相比具有一定的活性，当启动子从-1 301 bp逐渐缺失至-297 bp时，相对荧光素酶活性显著上调，在缺失至-297 bp时达到峰值，推测此区域可能存在负调控元件；当DNA片段从-297 bp缺失至-95 bp时，启动子活性不断下调；从-95 bp缺失至-24 bp时，启动子活性下调>90%，几乎无转录活性(图3)。因此推测，Fox O1启动子活性区域位于转录起始位点上游-95～-24 bp。

2.3 Fox O1及其不同启动子缺失片段过表达对Fox O1转录活性的影响

有研究表明，Fox O1过表达可抑制下游靶基因SREBP1的转录活性(Deng et al.,2012)，并促进AT-GL表达(Chakrabarti,Kandror,2009)。为验证Fox O1作为转录因子对自身基因转录的顺式调控作用，在山羊乳腺上皮细胞中共同转染Fox O1启动子不同缺失片段载体和Fox O1过表达载体或si Fox O1，利用荧光素酶报告基因系统检测启动子活性。结果表明，过表达Fox O1显著增加自身启动子活性(P<0.01)(图4A)，敲低Fox O1则显著降低Fox O1启动子活性(P<0.01)(图4B)。为进一步明确Fox O1对自身转录活性的影响，将Fox O1过表达载体及不同长度的Fox O1启动子缺失片段共同转染乳腺上皮细胞，检测双荧光素酶活性。结果显示，过表达Fox O1显著增加Fox O1启动子活性，当缺失至-861 bp时启动子活性上调超过2倍，这种促进作用随着片段缺失逐渐减弱(图4C)。根据上述结果推测，在Fox O1启动子的-861～+200 bp可能存在与Fox O1结合的顺式作用元件。

2.4 Fox O1启动子上结合位点突变对启动子活性的影响

基于以上结果，对转录起始位点上游861 bp的Fox O1启动子片段进行生物信息学分析，发现此区域存在2个结合位点FKH1和FKH2，分别位于-359和-619 bp。为明确这2个位点对FoxO1转录是否具有调控作用，将2个位点进行缺失突变，利用重叠延伸PCR技术获得不同位点突变的FoxO1启动子片段(图5A)，构建FKH1和FKH2位点单突变及双突变的FoxO1启动子载体。

图2 Fox O1启动子7个不同区域片段的扩增  

图1 Fox O1启动子的克隆及活性检测   

图3 Fox O1启动子不同长度缺失片段的荧光素酶活性   

图4 Fox O1转录因子对Fox O1启动子活性的顺式作用   

不同突变位点的Fox O1启动子载体和海肾荧光素酶(对照)报告基因载体(p RL-TK)共同转染山羊乳腺上皮细胞，48 h后检测荧光素酶活性。结果显示，FKH1位点突变导致启动子活性显著下调(P<0.05);FKH2位点突变对Fox O1启动子活性没有显著影响；2个位点同时突变使启动子活性显著下调(P<0.05)，与FKH1位点单个突变的启动子活性相似(图5B)。基于上述结果推测，FKH1位点在Fox O1自身转录调控中具有重要作用。

3、讨论

Fox O1是生物体内一类关键的细胞调控因子，主要通过转录和传导各种细胞因子信号发挥生物学功能。在小鼠肝脏组中，过表达Fox O1可显著增加脂肪酸转运相关基因的表达，减少组织中甘油三酯的含量(Ono et al.,2003)。然而，在Fox O1基因敲除的小鼠模型中，Fox O1的减少也增加了肝脏脂质积累(Zhang et al.,2020)。Fox O1敲除可显著增加小鼠肝脏中的胆固醇和游离脂肪酸，同时降低血液中低密度脂蛋白含量(Haeusler et al.,2010)。上述研究报道说明，Fox O1对脂肪酸代谢作用的差异可能与动物模型或组织差异有关。本课题组前期研究发现，在奶山羊乳腺上皮细胞中敲低Fox O1可提高脂肪酸合成相关基因的表达，同时细胞内的甘油三酯含量显著增加(He et al.,2020)，表明Fox O1在调控乳腺上皮细胞脂肪酸合成中具有关键作用。真核生物基因启动子含有基因表达调控网络的重要信息(张晓等,2010)，明确Fox O1基因启动子的结构和功能对于揭示其基因表达调控机制具有重要意义。

Fox O1对SREBP1启动子活性的调控在非反刍动物中已得到证明(Liu et al.,2010;Deng et al.,2012)。双荧光素酶实验结果表明，Fox O1通过降低小鼠肝X受体(liver X receptor,LXR)活性而抑制LXR与SREBP1启动子上LXR元件(LXR element,LXRE)位点的结合，最终降低SREBP1启动子活性(Liu et al.,2010)。在大鼠(Rattus norvegicus)肝细胞中，过表达Fox O1可显著降低SP1及SREBP1与SREBP1启动子的结合，进而影响启动子活性(Deng et al.,2012)。在人乳腺癌细胞中，Fox O1可结合于胰岛素样生长因子的启动子上，增强其转录活性(Vaziri-Gohar et al.,2017)。在本研究中，过表达Fox O1可显著上调Fox O1启动子活性；当Fox O1启动子缺失-861 bp时，过表达Fox O1可使Fox O1启动子活性上调超过2倍，但是这种促进作用随着片段缺失的增加而逐渐减弱，推测Fox O1启动子-861～+200 bp片段可能存在Fox O1调控的顺式作用元件。

研究表明，小鼠3T3-L1脂肪细胞经饥饿处理后，Fox O1显著增加ATGL启动子的转录活性，使ATGL基因的表达水平增加；而胰岛素降低Fox O1与ATGL启动子的结合，进而降低ATGL表达(VaziriGohar et al.,2017)。在细胞培基中添加支链氨基酸可提高Fox O1转录活性，进而降低SREBP1表达，最终抑制脂质合成(Huishou et al.,2020)。以上研究表明，外源添加因子通过影响转录因子的活性而改变靶基因的表达，而转录因子活性同样也受上游调控因子的影响。聚(ADP-核糖)聚合酶1 (poly(ADP ribose) polymerase 1,PARP1)能够直接结合到Fox O1启动子上2个独立的基序，并以一种不依赖聚合的方式抑制其转录(Tian et al.,2020)。同样，在小鼠C2C12细胞中，Fox O1基因的近端启动子包含8个GRE半位点和1个高度保守的SRE位点，糖皮质激素受体通过与Fox O1启动子上GRE位点结合而上调Fox O1表达(Qin et al.,2014)。虽然在小鼠Fox O1启动子上没有Fox O1的结合位点，但仍旧可以通过其他转录因子调控基因表达(Qin et al.,2014)。Fox O1调控的大部分基因的启动子不一定包含Fox O1结合位点(Dong et al.,2008)。在本研究中，Fox O1启动子从-1 301 bp缺失至-861 bp时，启动子活性有所上调，推测在该区域内存在某些负调控元件，尚需进一步的探究验证。此外，本研究发现Fox O1启动子存在2个结合位点，并通过缺失和定点突变验证了Fox O1通过结合近测的FKH1位点促进基因表达，这与之前的其他转录因子调控自身表达活性的研究一致(Xu et al.,2016;Yao et al.,2016)。而在山羊乳腺上皮细胞中，胰岛素可磷酸化Fox O1使其从细胞核转移至细胞质，但是胰岛素是否影响Fox O1的启动子活性尚需进一步的研究。

图5 FKH位点突变对Fox O1启动子活性的影响   

4、结论

本研究克隆获得1 500 bp的Fox O1基因启动子特异性片段，利用双荧光素酶系统确定启动子活性区域位于-95～-24 bp。此外，定点突变结果表明，Fox O1启动子中FKH1结合位点促进Fox O1基因转录。本研究为深入探讨Fox O1在山羊乳腺细胞脂质合成调控中的作用提供基础资料。

基金资助:国家自然科学基金(31772575;32202643);

文章来源:赫秋亚,罗军,高梁嘉慧等.奶山羊转录因子FoxO1启动子克隆及活性分析[J].农业生物技术学报,2024,32(03):578-586.