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蜂毒肽对前列腺炎大鼠模型的抗炎和抗增生作用的研究

2023-08-15 44 上传者：管理员

摘要：前列腺炎是全世界流行的泌尿外科问题，其发病率随年龄增长而增加。据估计，全世界前列腺炎的发病率在2%～16%[1],其引起的疼痛或泌尿症状会严重影响男性的日常生活和整体生活质量[2]。炎症在前列腺炎的发生过程中起着重要作用[3]。蜂毒肽(Melitten)是蜂毒的主要生物活性物质，具有非常好的抗炎作用。

关键词：
前列腺炎
成纤维细胞生长因子
抗增生
抗炎
蜂毒肽
趋化因子
黏附分子
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前列腺炎是全世界流行的泌尿外科问题，其发病率随年龄增长而增加。据估计，全世界前列腺炎的发病率在2%～16%[1],其引起的疼痛或泌尿症状会严重影响男性的日常生活和整体生活质量[2]。炎症在前列腺炎的发生过程中起着重要作用[3]。蜂毒肽(Melitten)是蜂毒的主要生物活性物质，具有非常好的抗炎作用。蜂毒肽的抗炎和镇痛作用归因于其对中枢神经系统突触中兴奋的抑制作用[4],及其对多种炎症前信号传导的抑制作用[5]。本研究通过建立前列腺炎模型大鼠，考察蜂毒肽的抗炎和抗增生作用及其作用机制。

一、材料与方法

1、材料

动物成年雄性SD大鼠，体质量180～220 g,鼠龄7周龄，购自上海中医药大学实验动物中心。动物许可证号：SYXK(沪)2017-0008。本实验经昆明医科大学第一附属医院动物伦理委员会批准[伦理批号：2017科研第(17)号]。

药品与试剂蜂毒肽，规格：每瓶25 mg,纯度：≥85%,批号：M2272,雌二醇，规格：每瓶250 mg,纯度：≥98%,批号：E8875,均由美国Sigma-Aldrich公司生产；白细胞介素(interleukin, IL)-6、IL-8、IL-17酶联免疫吸附试验试剂盒，均由北京索莱宝科技有限公司生产；TaqMan Fast Universal PCR Master Mix,美国Applied Biosystems公司生产；极迟抗原(very late antigen, VLA)-4、CC趋化因子配体(CC chemokine ligand, CCL)-2、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR)-1,均由美国Abcam公司生产。

仪器Prism7700荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)仪，美国ABI公司产品；DP25显微镜，日本Olympus公司产品。

2、实验方法

2.1模型建立[6]6]

腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹部开口，摘除睾丸。术后按0.25 mg·kg-1的剂量皮下注射雌二醇(溶于大豆油中),每天1次，连续4周。4周后，随机抽取2只大鼠并处死，分离前列腺组织，当观察到前列腺充血、水肿，且苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察到炎性细胞浸润，则提示造模成功。空白组仅注射等体积大豆油。

2.2动物分组与给药方法

将模型大鼠随机分为模型组和低、中、高剂量实验组，每组10只。另取10只大鼠作为空白组。建模后，低、中、高剂量实验组分别给予前列腺腹叶注射0.25、0.50和1.00 mg·kg-1的蜂毒肽(溶于0.9%NaCl 0.2 mL)。空白组和模型组均给予前列腺腹叶注射0.9%NaCl 0.2 mL。5组大鼠均治疗4周。

2.3样本采集

治疗结束后，分离大鼠血清，保存在-80℃的冰箱中。将一部分前列腺组织用石蜡包埋，通过旋转切片机切成5μm厚的切片，用于组织学染色。另一部分前列腺组织置于冰的RIPA裂解液缓冲液中，用匀浆器制成匀浆，以3 000 r·min-1离心10 min,将上清液转移至新管中，并置于-80℃的冰箱中保存。

2.4用酶联免疫吸附试验法测定细胞因子的含量[7]7]

严格按照试剂盒说明书的步骤进行操作，用酶联免疫吸附试验法检测血清中IL-6、IL-8和IL-17的水平。

2.5用实时荧光定量PCR法检测单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein -1,MCP-1)、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule -1,VCAM-1)和成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor -2,FGF-2)mRNA的表达水平[8]8]

用TRIzol提取前列腺组织总RNA。用高容量cDNA反转录试剂盒将纯化的总RNA反转录成cDNA。合成第一链cDNA后，用Milii-Q水稀释cDNA混合物。在荧光定量PCR仪上，用TaqMan Fast Universal PCR Master Mix对稀释的cDNA进行PCR。反应程序如下：95℃变性3 s, 62℃退火20 s, 72℃延伸30 s, 40个循环。以β-actin为内参，用2-△△CT法计算目的基因的相对表达量。

2.6用蛋白质印迹法检测VLA-4、CCL-2和FGFR-1蛋白的表达水平[9]9]

用蛋白质测定法测定总蛋白质的含量。通过10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质(50μg)分离，并通过电印迹转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜在含有5%脱脂奶的TBST缓冲液中封闭1 h,与一抗在4℃孵育过夜，然后在室温下与相应的辣根过氧化物酶结合的山羊抗大鼠免疫球蛋白G二抗孵育1 h。用ECL试剂进行显影。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参，计算目标蛋白的相对表达水平。

2.7用HE染色和Masson三色染色方法检测组织病理学变化[10]10]

按HE染色试剂盒说明书的方法对前列腺组织进行染色，评价前列腺的组织病理学变化。按Masson三色染色试剂盒说明书的方法对前列腺组织进行染色，评估大鼠前列腺组织的胶原沉积。用显微镜对前列腺组织进行观察。

3、统计学处理

用SPSS 18.0软件进行统计分析。实验数据用x¯±s表示，比较用单因素方差分析和LSD事后检验。

二、结果

1蜂毒肽对血清炎症介质的影响

低、中、高剂量实验组分别给予0.25、0.50和1.00 mg·kg-1的蜂毒肽；空白组和模型组均给予0.9%NaCl。

模型组血清中IL-6、IL-8和IL-17水平均较空白组明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组血清中IL-6、IL-8和IL-17水平均明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表1。

2蜂毒肽对前列腺中MCP-1、VCAM-1和FGF-2 mRNA表达的影响

低、中、高剂量实验组和模型组、空白组的MCP-1 mRNA表达量分别为2.86±0.23、1.81±0.10、1.42±0.12、4.45±0.28和1.00±0.04,VCAM-1 mRNA表达量分别为2.17±0.09、1.76±0.12、1.22±0.08、3.32±0.30和1.00±0.03,FGF-2 mRNA表达量分别为1.62±0.12、1.40±0.09、1.25±0.10、2.02±0.12和1.00±0.04。与空白组相比，模型组前列腺组织中MCP-1、VCAM-1和FGF-2mRNA表达量均显著增加，差异均有统计学意义(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组前列腺组织中MCP-1、VCAM-1和FGF-2 mRNA表达量均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

表1 5组大鼠血清中白细胞介素(IL)-6、IL-8和IL-17水平的比较(x¯±s)

3蜂毒肽对前列腺中VLA-4、CCL-2和FGFR-1蛋白表达的影响

低、中、高剂量实验组和模型组、空白组的VLA-4蛋白相对表达水平分别为0.66±0.05、0.52±0.05、0.44±0.03、0.85±0.07和0.34±0.04,CCL-2蛋白相对表达水平分别为0.76±0.05、0.61±0.04、0.53±0.03、0.96±0.05和0.42±0.02,FGFR-1蛋白相对表达水平分别为0.83±0.05、0.69±0.05、0.57±0.03、0.97±0.06和0.44±0.04。与空白组相比，模型组前列腺组织中VLA-4、CCL-2和FGFR-1蛋白相对表达水平均显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组前列腺组织中VLA-4、CCL-2和FGFR-1蛋白相对表达水平均明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见图1。

4蜂毒肽对前列腺组织病理学的影响

HE染色结果显示：空白组大鼠的前列腺组织形态正常；与空白组相比，模型组大鼠的前列腺有明显的组织炎症、间质水肿和组织结构破坏；与模型组相比，低、中、高剂量实验组大鼠的前列腺中炎症细胞的浸润程度明显减轻，基质增生减少和组织结构明显恢复。结果见图2。

图1 5组大鼠前列腺组织中极迟抗原-4(VLA-4)、CC趋化因子配体-2(CCL-2)和成纤维细胞生长因子受体-1(FGFR-1)蛋白的表达情况

5蜂毒肽对前列腺增生的影响

如图3所示：低、中、高剂量实验组和模型组、空白组的纤维化面积分别为(14.38±0.63)%、(10.33±1.25)%、(5.33±0.28)%、(22.80±1.58)%和(1.92±0.10)%。Masson三色染色显示：与空白组相比，模型组大鼠的前列腺基质区域胶原沉积显著，纤维化面积显著增加(P<0.05)。与模型组相比，低、中、高剂量实验组胶原沉积均受到显著抑制，纤维化面积均显著减少(均P<0.05)。

图2 5组大鼠前列腺组织的病理学变化(苏木精-伊红染色，×100)

图3 5组大鼠前列腺组织的增生情况(Masson三色染色，×100) 下载原图

Figure 3 The hyperplasia of prostate tissue in 5 groups of rats (Masson trichrome staining, × 100)

A-E refer to figure 1.

三、讨论

炎症是慢性前列腺炎与增生之间的关键机制[11]。IL-6作为多效细胞因子参与调节免疫细胞的迁移以及慢性免疫应答[12]。IL-8通过趋化因子吸引单核细胞和中性粒细胞进入病变区域，并且在诱发痛觉过敏中起着关键作用。IL-17可诱导成纤维细胞上调促血管生成因子的表达，促进内皮细胞的迁移，增加炎症细胞因子家族其他成员的生成(如IL-6和IL-8)[13]。本研究结果发现，蜂毒肽能显著降低前列腺炎大鼠血清中IL-6、IL-8和IL-17水平，从而抑制了前列腺炎的进展。这说明蜂毒肽在治疗前列腺炎中具有一定的抗炎和抗增生作用。

VLA-4表达上调参与白细胞的迁移、血管壁的黏连和外渗过程，此外，VLA-4与CC趋化因子协同促进白细胞向炎症部位的浸润，因此，VLA-4可能是前列腺炎患者的治疗靶点[14]。LOBERG等[15]研究表明，对人前列腺癌细胞VCaP皮下注射诱导的雄性SCID荷瘤小鼠全身性给予CCL-2中和抗体(CNTO888和C1142)治疗，在第50天时肿瘤体积分别减少了42%和55%,同时减弱了巨噬细胞浸润，降低了微血管密度。FGFR-1是FGF-2的受体，FGF-2/FGFR-1信号传导过程在成纤维细胞生长、血管形成、创伤愈合及肢体再生中具有重要作用。FGF-2/FGFR-1信号的过度激活会导致肝、肺、肾等器官或组织的纤维化，而阻断该信号则可以抑制纤维化程度[16]。本研究结果发现，蜂毒肽明显抑制了前列腺炎大鼠前列腺组织中MCP-1、VCAM-1和FGF-2 mRNA的表达，并抑制VLA-4、CCL-2和FGFR-1蛋白的表达。这表明蜂毒肽可以通过抑制前列腺组织中趋化因子、黏附分子和成纤维细胞生长因子的过度激活来发挥治疗作用。

参考文献:

[6]中华中医药学会,中药实验药理专业委员会慢性前列腺炎动物模型制备规范(草案)[J]中国实验方剂学杂志,2018,24(19):10-14.

[7]宋竖旗,张亚强,刘咏梅,等丹蒲胶囊对自身免疫性前列腺炎模型IL-2､IL-8､IL-10的影响[J].中国中医基础医学杂志,2010,16(8):662-66

[8]宋竖旗,刘咏梅,王文娟,等丹蒲胶囊对自身兔疫性前列腺炎模型NGF表达的影响[J]北京中医药大学学报,2009,32(5):317-320.

[9]王晶,梁朝朝,樊松,等逼尿肌相关蛋白在慢性前列腺炎大鼠模型中的表达及意义[J]安徽医科大学学报,2015,50(8):1072-1076.

[10]何昀,张唯力,毕杨,等p38丝裂原活化蛋白激酶在大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型中的表达[J]中国男科学杂志,2008,22(12)-10-14.

[11]宋武,李冬阳,袁海川,等.前列腺液中L-8浓度与前列腺增生组织中bFGF､BcI-2表达的相关性[J]中华医学杂志,2016 ,96(2):104-107.

[12]张庆云,莫曾南,刘硒碲姜黄素对慢性非细菌性前列腺炎大鼠TNF-a､IL-6和I -8表达的影响[J].中华男科学杂志,2010,16(1):84-88.

基金资助:云南省卫生科技计划基金资助项目(2017NS151);

文章来源:周成刚.蜂毒肽对前列腺炎大鼠模型的抗炎和抗增生作用的研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(15):2193-2197.DOI:10