几丁质（chitin）是由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-（1,4）键连接的线性多糖[1]，也是地球上含量仅次于纤维素的天然多糖生物大分子[2]，但因其不溶于水和一般有机溶剂，难以开发利用其商业价值[3]。壳聚糖（chitosan）是几丁质脱乙酰度大于55%的产物[4]，也是目前已知唯一的碱性多糖[5]。壳聚糖分子链上存在的游离氨基使其溶解性能优于几丁质[6]。此外，壳聚糖还具有良好的降解性和生物相容性，对人体无害，并且具有抑菌、降血压、降胆固醇和抗癌等作用，广泛应用于食品、医药、农业、化工、化妆品和环境治理等领域[7,8,9,10]。

目前，壳聚糖的制备方法有化学热碱法和生物酶法[11]。热碱法是工业上最常用的方法，即向40%的氢氧化钠或氢氧化钾中加入几丁质后70℃加热制备壳聚糖[12]。该方法虽操作简单，但存在反应时间长、产品脱乙酰度不稳定和排放物污染环境等缺点[13]。生物酶法利用几丁质脱乙酰酶催化几丁质脱乙酰制备壳聚糖[14]，其反应条件温和，产品的脱乙酰度稳定、可控，最为关键的是生产过程绿色环保[15]。CDA在碳水化合物活性酶数据库（www.cazy.org）中属于碳水化合物脂酶家族4[16]。来自海洋节杆菌Arthrobactersp.AW19M34-1的CDA(ArCE4）是目前已知唯一可以催化不溶性几丁质脱去乙酰基的细菌CDA，易于在大肠杆菌中可溶性表达[17]。但是，重组ArCE4稳定性和活性容易受温度、pH值和其它外界因素的影响，增加了壳聚糖生产成本。

固定化酶技术为提高CDA稳定性提供了有效的解决途径。固定化酶技术将游离酶制作成具有催化活性但不溶于水的固相酶，提高了生物酶的稳定性[18]。游离酶经过固定后还易于从产物中分离，可以循环使用，降低了生产成本[19]。海藻酸钠包埋法是最常用和最有效的酶固定方法之一[20]，该法不会对酶的构象产生影响，并且酶活回收率高，但包埋条件对酶活影响较大[21]。基于此，本研究设计单因素试验与响应面试验对海藻酸钠包埋固定ArCE4的工艺进行优化，并研究固定化酶的酶学性质和操作稳定性。

1、材料与方法

1.1材料与试剂

重组Arthrobactersp.CDA：江苏海洋大学海洋生物酶工程实验室制备保存；海藻酸钠、氯化钙（calciumchloride,CaCl2）：国药集团化学试剂有限公司；戊二醛（glutaricdialdehyde,GA）：阿拉丁试剂有限公司；对硝基-N-乙酰苯胺：上海博微生物科技有限公司。所用试剂皆为分析纯。

1.2仪器与设备

电热恒温水浴锅（HW·SY）：海源仪器厂；高速冷冻离心机（日立CR22G）：日本HITACHI公司；新世纪紫外可见分光光度计（T6）：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3方法

1.3.1固定化酶的制备

参考王静等[22]以海藻酸钠为载体、戊二醛为交联剂对L-阿拉伯糖异构酶固定的方法，对CDA进行固定。将海藻酸钠溶液与酶液按2∶1（体积比）混合，搅拌均匀。用5mL注射器将上述混合溶液以缓慢速度滴入CaCl2溶液中，形成尺寸相似的固定化酶凝胶颗粒。4℃静置硬化一段时间，用磷酸缓冲盐溶液与超纯水洗涤凝胶颗粒。干燥后加入一定浓度的GA溶液，25℃振荡交联数十分钟后，用PBS与超纯水洗涤凝胶颗粒，4℃保存在PBS中用于后续试验。

1.3.2单因素试验优化固定条件

以30.0g/L的海藻酸钠，30.0g/L的CaCl2，静置硬化4h,0.05%的GA溶液，振荡交联30min为基本条件，分别对海藻酸钠浓度、CaCl2浓度、静置硬化时间、GA浓度和振荡交联时间进行单因素优化。

1.3.3响应面法优化固定条件

基于单因素试验结果，选取对固定化CDA酶活影响较大的海藻酸钠浓度、CaCl2浓度和静置硬化时间为考察因素，以CDA的酶活为考察指标，根据BoxBehnken原理设计三因素三水平响应面试验，试验设计见表1。使用Design-Expert.V8.0.6.1软件对结果进行响应面回归分析。

表1响应面法分析因素及水平

1.3.4最优条件验证试验

分析响应面法试验数据得到最优的CDA固定条件，用该条件进行5次重复验证，测定固定化CDA的相对酶活，取其平均值与预测值比较。

1.3.5固定化CDA酶学性质的测定

1.3.5.1热稳定性

将固定化酶和游离酶分别置于20、30、40、50、60℃水浴锅中保温2h后，于30℃进行酶促反应，测定酶活性以研究固定化酶的热稳定性。

1.3.5.2pH值稳定性

将固定化酶和游离酶分别置于pH3～9的缓冲液中保存20h后，于30℃进行酶促反应，测定酶活性以研究固定化酶的pH值稳定性。

1.3.5.3操作稳定性

将固定化酶在相同条件下连续操作10次，测定相对酶活。

1.3.6CDA酶活性的测定

参考来蒋丽等[23]测定CDA酶活性的方法并稍作修改。试管中加入3mL0.05mol/LpH7.0的PBS和1mL200mg/L的对硝基-N-乙酰苯胺溶液，30℃预处理15min后加入1mL酶液，酶促反应30min，沸水浴终止酶促反应，5000r/min离心15min，取上清液在400nm处测定上清液吸光值。空白对照组添加1mL灭活酶液，其余不变。

固定化酶活性的测定是以0.5g固定化酶代替1mL游离酶，酶促反应30min后取出固定化酶颗粒终止反应。以添加0.5g用灭活酶液制作的固定化酶颗粒为空白对照。

1.3.7数据处理与分析

每组试验设置3组平行试验，用平均值±标准方差的形式表示试验结果，并用SPSSStatistics25.0软件对结果进行统计学分析。

2、结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1海藻酸钠浓度对固定化酶活性的影响

海藻酸钠浓度对固定化酶活性的影响见图1。

图1海藻酸钠浓度对固定化酶活性的影响

如图1所示，固定化酶活性随着海藻酸钠浓度的增加而升高，当浓度达到30.0g/L时酶活性最高；随着海藻酸钠浓度继续升高，酶活性显著降低。这可能因为当海藻酸钠浓度过低时，与CaCl2反应形成的凝胶颗粒孔径大，CDA包埋不紧密，易流失，所以酶活性低；当浓度过高时，溶液黏度大，与CDA溶液混合时酶液分散不均匀，并且制成的凝胶颗粒形状不规则，有拖尾，影响CDA与底物结合，所以酶活性降低。

2.1.2CaCl2浓度对固定化酶活性的影响

CaCl2浓度对固定化酶活性的影响见图2。

图2CaCl2浓度对固定化酶活性的影响

如图2所示，当CaCl2浓度为30.0g/L时，固定化酶活性最高。推测原因为Ca2+浓度过低时，凝胶交联度低，颗粒不易形成，酶包埋不紧密，流失过多，所以酶活性低；Ca2+浓度过高时，凝胶过度交联，颗粒表面布满Ca2+，网状结构孔径小，阻碍酶与底物结合，所以酶活性低。

2.1.3硬化时间对固定化酶活性的影响

硬化时间对固定化酶活性的影响见图3。

图3硬化时间对固定化酶活性的影响

如图3所示，硬化2h时，固定化酶活性最高；继续硬化，酶活性降低。说明硬化时间过长会导致交联过度，凝胶颗粒表面网状结构孔径小，CDA包埋过于紧密，底物难以与其结合。

2.1.4GA浓度对固定化酶活性的影响

GA浓度对固定化酶活性的影响见图4。

图4GA浓度对固定化酶活性的影响

如图4所示，当GA浓度为0.025%时，固定化酶活性最高；当GA浓度增加时，酶活性显著降低。这可能因为适当浓度的GA可以强化海藻酸钠分子与CDA的交联，增加固定化CDA的稳定性，而高浓度的GA溶液会使蛋白质变性，从而导致丧失酶活性。

2.1.5交联时间对固定化酶活性的影响

图5交联时间对固定化酶活性的影响

如图5所示，固定化酶活性随着交联时间的增加而提高，当交联时间为30min时，酶活性最高；继续延长交联时间，酶活性降低。这是因为在GA的作用下，CDA与海藻酸钠凝胶活性位点进行结合，当结合位点达到饱和时，GA开始影响CDA的酶活，导致酶活性降低。

2.2响应面试验结果

2.2.1响应面数据分析

试验设计与结果见表2。

对结果进行响应面分析，得到固定化酶活性（U）对海藻酸钠浓度（A）、CaCl2浓度（B）和静置硬化时间（C）的三元二次回归方程为：

表2响应面法试验设计与结果

回归方程的方差分析见表3。

表3回归模型方差分析

注：*表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01。

对测得的固定化酶活性进行方差分析，模型的P值=0.0008<0.01，差异极显著，失拟项的P值=0.3916>0.05，差异不显著。表明该模型与试验数据拟合合理，回归方程有较高可信度，误差小，能够用来对固定化酶的酶活性进行预测。模型中一次项A和C、二次项A2与交互项AB、AC和BC对固定化酶活性影响显著，二次项B2和C2对固定化酶活性影响极显著。说明各固定条件对固定化酶活性影响并非线性关系。

2.2.2响应面优化结果与分析

响应面3D图可以直接反映各固定条件间的交互作用对固定化CDA酶活的影响。等高线图可以体现出各因素交互作用的强弱，椭圆形的等高线表示相互作用显著；越接近正圆，交互作用越不显著。各因素对固定化酶活性的影响见图6。

图6各因素对固定化酶活性的影响

c.硬化时间与CaCl2浓度的交互作用

如图6所示，海藻酸钠浓度和CaCl2浓度之间以及海藻酸钠和硬化时间之间交互作用较强，而CaCl2浓度和硬化时间之间交互作用较弱。结合各因素交互作用对CDA相对酶活性影响的响应面图和回归模型，优化海藻酸钠包埋法固定CDA的条件，结果为海藻酸钠浓度27.8g/L、CaCl2浓度31.0g/L、静置硬化1.84h。各因素取最优值后预测固定化酶活性可达2.13U/mL。

2.3最优固定条件验证结果

5次重复试验的结果为1.98、2.07、2.27、2.01、2.19U/mL，平均值为2.10U/mL，与预测值2.13U/mL相比偏差极小，表明模型可信度高。

2.4固定化酶的酶学性质

2.4.1热稳定性

固定化酶与游离酶的热稳定性见图7。

图7固定化酶与游离酶的热稳定性

由图7可知，CDA适合储存在低温环境中，随着储存温度的升高，损失的酶活性越多。当储存温度为45℃时，游离酶几乎没有酶活性，固定化酶还保留最高酶活20.05%的酶活性。该结果表明CDA的固定化可以提高其温度稳定性。

2.4.2pH值稳定性

固定化酶与游离酶的pH值稳定性见图8。

图8固定化酶与游离酶的pH值稳定性

由图8可知，CDA储存在pH7的缓冲液中效果最佳。pH3条件下放置20h后，游离酶几乎没有酶活性，固定化酶还保留最高酶活36.70%的活性；pH9时，游离酶还保留最高酶活32.60%的活性，而固定化酶还保留最高酶活52.70%的活性。该结果表明经过固定后的CDA,pH值稳定性有所提高。

2.4.3操作稳定性

固定化CDA的操作稳定性见图9。

图9固定化CDA的操作稳定性

如图9所示，固定化酶活性随循环操作次数的增加而降低。这是因为连续操作使凝胶强度降低，酶漏失过多，导致酶活性降低。固定化酶在连续操作6次后，酶活性依然保持最高酶活性的60.39%。

3、结论

本试验使用海藻酸钠包埋法对CDA进行固定，通过设计单因素试验和响应面试验对固定条件进行优化，得到最优条件：海藻酸钠浓度为27.8g/L,CaCl2浓度为31.0g/L，硬化1.84h,GA浓度为0.025%，交联30min。重复试验验证了优化结果，与预测值偏差较小。通过对比固定化酶和游离酶的酶学性质，发现固定化酶的热稳定性和pH值稳定性相较于游离酶有明显提升。固定化酶的操作稳定性研究表明，在连续操作6次后，固定化酶活性依然保持最高酶活的60.39%。CDA是催化几丁质脱乙酰制备壳聚糖的酶，提高几丁质脱乙酰的稳定性可以降低成本，提高壳聚糖制备效率。本研究为固定化CDA催化制备壳聚糖的工业应用奠定了试验基础。

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基金:国家自然科学基金项目(31772016);江苏省海洋科技创新专项(HY2018-10);江苏省“六大人才高峰”第十二批高层次人才项目(SWYY-195);江苏省“333高层次人才培养工程”(BRA2019243);第48批“留学归国人员”科研启动基金;连云港市“521高层次人才培养工程”项目;江苏省研究生实践创新计划(KYCX19-2294).