流行性感冒（简称流感）病毒是流感的病原体，该病毒为单股负链RNA病毒，归属于正粘病毒科。根据其核蛋白（nucleoprotein,NP）和基质蛋白（matrix protein,M）的抗原性不同，可分为甲、乙、丙、丁（或A、B、C、D)4型[1]。此外，甲型流感病毒又根据表面的血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA）的不同分为不同亚型[2]。HA分为18种亚型，NA分为11种亚型。两种抗原亚型之间组合形成了具有不同抗原特性和致病性的甲型流感病毒亚型；乙型流感病毒无亚型之分，随着HA持续不断进化，逐渐形成Victoria系和Yamagata系[3]。目前，在人群中流行的主要有甲型流感病毒（H1N1、H2N2、H3N2亚型）和乙型流感病毒中的Victoria系[4]，其中H1N1和H3N2是引起季节性甲型流感的主要亚型，而其他甲型流感亚型的自然宿主要是鸟类和动物，其中H5、H7、H9亚型对家禽影响最大。

2009年3月在墨西哥和美国先后爆发了大规模流感，后经证实是一种新型甲型H1N1流感病毒，是由欧洲猪流感病毒（提供NA和M基因）和北美三源基因重配的猪流感病毒（提供PB2、PB1、PA、HA、NP和NS基因片段）通过基因重配的产物[5]。据WHO统计，此次流感大流行蔓延到214个国家和地区，导致近20万人死亡[6]。至今，全世界每年约有5%成人和20%儿童感染甲型或乙型流感[7]，对世界公共卫生安全造成了一定意义的威胁。接种流感疫苗是预防流感的有效手段，但是现有疫苗无法对所有正在出现变异的单一流感病毒亚型提供保护，并且疫苗接种保护率也有待考证。所以，在流感流行季节、疫情暴发和存在流感高危因素时，流感病毒的早期诊断是刻不容缓的事。流感病毒的诊断具有一定的挑战性，因为其临床表现与鼻病毒、副流感病毒、腺病毒和新型冠状病毒有相似之处[8]，所以，“早发现、早隔离、早诊断、早治疗”是预防和控制流感传播的有效方法。及时快速的检测方法也有助于患者在感染后进展为更严重之前进行早期对症治疗。本文就流感病毒感染实验室诊断技术应用进展作一述评，为其早期诊断提供参考。

1、病毒培养

狗肾传代细胞（Madin-Darby canine kidney,MD-CK）是流感病毒的敏感细胞[9]，且细胞代谢特性稳定，适合大规模培养流感病毒，因此目前常用MDCK细胞分离培养流感病毒[10,11,12]。使用流感病毒样本感染已建立的细胞系，观察细胞病变作用，并通过特异性抗体染色、血凝抑制试验（hemagglutination inhibition test,HI）和免疫荧光显微镜进行确定[13]。HI不仅可以用于鉴定待检病毒的型别及亚型，也常用于检测同型别病毒的抗原变异情况[14]。基于病毒培养的免疫荧光法用于鉴定病毒具有快速、特异的优点，细胞内的病毒可被荧光素标记的特异性抗体着色，在荧光显微镜下可见斑点状黄绿色荧光，根据所用抗体的特异性判断为何种病毒感染[15]。整个病毒培养过程耗时长，操作周期长，对实验人员和环境要求高，因此难以快速检测病毒，也不适用于大量样本的检测筛查。不过，病毒培养却能够获取病毒株，这对于研究病毒基因特性、抗原性、疫苗研发以及耐药性方面非常具有意义。

2、免疫学检测

免疫学检测主要是通过抗原检测患者标本中的病原体抗体或通过抗体检测患者标本中病原体的抗原。常用的免疫学检测方法如HI、中和试验（neutralization test,NT）、免疫荧光法（immunofluorescence,IF）、免疫胶体金技术（immune colloidal gold technique,ICG）和ELISA等，与其他技术相比，免疫学检测具有简单、快捷、成本低廉的优点，但是不适用于早期感染，且无法量化病毒和出现假阳性率等缺点。近年来，免疫学方法不断发展，如基于纳米酶的免疫学检验备受关注，使免疫学检查中的不足得到了一定程度的优化。

2.1 HI

HI是确定人和其他动物模型自然感染和接种疫苗后血清中是否存在特异性流感病毒HA抗体的最常用方法[16,17]。该试验是基于血凝反应的原理，通过观察病毒与红细胞之间的相互作用来评估抗体对病毒的中和抑制效果。通过比较添加不同浓度待测样品后的血凝情况，可以确定待测样品中的抗体滴度，即最低有效稀释度。抗体滴度越高，说明抗体对病毒的中和抑制效果越强。但是HI的重复性较低，有时会与其他病毒发生交叉反应。HI测定的标准化可提高该方法的可重复性[18]。在一项研究中，使用HI和补体结合试验（complement fixation,CF）对120例患者进行了当前流感毒株检测，结果发现HI比CF更敏感，但特异度较低[19]。CF由于灵敏度较低已被HI、NT所取代。

2.2 NT

NT可用于检测病毒、细菌、毒素和其他生物分子的抗原性质，也可以用于疫苗和药物的研发。基本原理是基于病毒特异性抗体能够中和病毒的特性。NT常用于检测季节性或禽流感毒株的抗体效价。NT测定法较HI测定法更为灵敏，NT测定法中病毒中和抗体的特异性高，持续时间久，以往受显性或隐性感染后，血中可长期存在中和抗体，所以适用于流行病学调查或人群免疫水平研究，但因试验方法繁杂，且需要在认证的BSL2+和BSL3+实验室中使用其感染性病毒，所以在常规诊断中的应用受到限制[13]。

2.3 IF

IF包括直接免疫荧光技术、间接免疫荧光技术、时间分辨荧光免疫分析法和补体法。IF用于检测临床标本中病毒抗原，具有快捷、特异的优势。检测原理是细胞或组织中的抗原或抗体，与标记了相应荧光素抗体或抗原结合形成抗原-抗体复合物，之后肉眼在显微镜下进行观察，标本中的抗原或抗体可通过因激发光照射发出的荧光而被定量检测。免疫荧光技术灵敏度高、特异性强、观察直观，相对于病毒培养，大大缩短了试验时长。但其依赖特异性高、稳定性好的抗体，并进行荧光标记，这可能大大增加了试剂的成本和操作的复杂性。

2.4 ICG

ICG是继免疫荧光技术、放射同位素示踪技术和酶标记三大技术之后，以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型免疫标记技术[20]，具有操作简单、快捷直观、灵敏度高等优点，是目前最广泛的免疫学检测技术之一。其中应用最多的是胶体金免疫层析法（gold immunochromatography assay,GI-CA）。GICA基本原理是将特异性抗原或抗体以条带状固定于膜上，并采用胶体金标记试剂吸附在结合垫上，样品在层析作用下向前移动，当样品中存在相应的特异性病毒抗原时，可与结合垫处金标抗体相结合，并聚集于检测带上，大量积聚后可肉眼观察到显色结果。王玺荣等[21]建立了一种基于量子点荧光免疫层析技术的高准确率快速检测甲型/乙型流感病毒的方法，该方法不仅能够通过简单的步骤进行结果定性，而且还可以通过一个低成本仪器定量检测病毒浓度。但是仍需要检测仪器观察定量结果，导致该方法在诸如欠发达地区、家庭自测等场景的应用局限性。另外，GICA的灵敏度和特异度受抗体或抗原的影响较大，需要高质量的抗体或抗原来提高其准确性。

2.5 ELISA

ELISA因灵敏度高、操作简单、特异性强等特点成为目前发展速度最快和应用范围最广泛的免疫学技术，其基本原理是采用酶蛋白分子来标记抗体或抗体分子形成酶标抗体，酶标抗体与结合在固相载体上的抗原或抗体进行特异性结合，用洗涤法将液相中游离成分洗出。滴入底物溶液，通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应存在，从而推断待测抗体或抗原的量。厦门大学在2009年甲型H1N1pdm09流感大流行期间进行了一项新的基于夹心ELISA的诊断研究，采用特异性单克隆抗体和辣根过氧化物酶连接兔抗HA多克隆抗体，该方法具有较高的灵敏度[22]。邓涛等[23]建立的NA双抗体夹心ELISA定量检测法具有良好的准确度、重复性、中间精密度和耐用性，可用于流感疫苗的检测及生产过程中对NA含量的质量控制。但需要注意的是，ELISA有时也会出现交叉反应，这就可能导致假阳性或者假阴性的结果，需要进一步确认和鉴定。

2.6 纳米酶免疫学技术

2007年，阎锡蕴团队发现了纳米粒子具有辣根过氧化物酶的催化活性，能够在温和的生理条件下，催化酶的底物并遵循酶促反应动力学将其转化为产物，并在2015年成功研制了用于埃博拉病毒快速检测的“纳米酶试纸”[24]，该试纸条充分利用了磁纳米材料的催化活性、磁性和显色反应，其测试灵敏度比常规试纸条高100倍。纳米酶作为2022年度化学领域十大新兴技术之一，在免疫学、生物学、疾病监测等领域显示出了巨大的应用潜力。该方法的基本原理就是将纳米酶与检测目标相关的抗体或其他生物分子进行结合，使纳米酶获得特异性识别能力，之后与目标抗原结合时，会催化产生可检测的信号，以此作为病毒检测的结果。采用模拟天然酶的催化位点或为反应提供多价元素，现已成为天然酶的替代品。刘键等[25]建立了磁珠纳米酶催化免疫层析试纸条用于检测H7N9亚型禽流感病毒，该方法的灵敏度比胶体金法可提高1～2个数量级，与目前常用的核酸检测方法相比，检测时间大大缩短，适用于即时检测（point of care test,POCT）。但是目前纳米酶的种类较少，且纳米酶的质量和性能参差不齐，所以方法的可靠性和标准化还有待进一步研究和提升。

3、分子生物学试验

随着核酸扩增PCR的发展，其在病毒检测方面得到了广泛的应用[26]。PCR检测基于病毒的特异性DNA或RNA序列，用于检测流感病毒感染的分子生物学方法主要包括实时荧光逆转录PCR(real-time reverse transcription PCR,real-time RT-PCR）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）、连接酶链反应（ligase chain reaction,LCR）和基于核酸序列的扩增等。与基于抗原的免疫学检测法相比，能够更早的监测到病毒，且PCR检测更加灵敏。其中real-time RT-PCR不仅能够有效解决PCR造成的污染，同时能够实现自动化检测，特异度较高，目前已经成为临床监测流感病毒的“金标准”[27]。近年来，PCR技术不断创新，微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)[28]的发展进一步提高了病毒检测的准确度，并且同时具有良好的抗干扰能力，表现出了较高的应用价值和发展前景，但是由于其设备和耗材昂贵，dd PCR的普及及应用具有一定的限制。

3.1 real-time RT-PCR

real-time RT-PCR是使用特异性引物进行检测并分型流感病毒亚型。该方法包括从样本中提取病毒RNA，通过逆转录酶将RNA转录成互补的DNA，并对产物进行荧光扩增检测，通过荧光强度观察产物量的变化，从而建立荧光扩增曲线图[29]。多重real-time RT-PCR方法中通过多条特异性引物，可以在一个反应中进行检测多种流感病毒亚型。该方法敏感、快速、特异性强，能直接检测临床标本，该技术的灵敏度在所有传统检测方法中较高。另一方面，也有研究指出该检测方法实验过程耗时长，例如Shigemoto等[30]用多重荧光real-time RT-PCR方法检测诺如病毒，需要6 h时长；采用核酸扩增技术，准确检出H7亚型禽流感病毒通常需要4～6 h。另外，该方法诊断费用较高、设备昂贵，需要特殊的实验室条件是其弊端所在。

3.2 LAMP

LAMP测定法常用于流感病毒、严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndromes,SARS）、鼻病毒、腺病毒等多种病毒的检测。通常使用DNA聚合酶或RNA逆转录酶和两套引物来识别目的DNA上的6个不同位点[31]，采用光度法扩增目的基因的敏感性一般与real-time RT-PCR检测相似。一种特定的逆转录入LAMP(reverse transcription LAMP,RT-LAMP）方法被开发出来用于流感病毒的特异性评估和分型[32]，其特异度为93.8%。LAMP测定法在等温条件下进行，不需要复杂的温度循环步骤，因此可在短时间内完成扩增反应。但是相比普通PCR技术，LAMP技术在引物设计上更为复杂，需要设计多个特异性引物来扩增目标序列，这增加了技术上的挑战和实验的复杂性。所需的试剂盒和设备成本较高，这限制了其在某些资源有限环境中的应用。

3.3 dd PCR

dd PCR是基于传统PCR方法的改进。根据DNA有限稀释法和松泊分布[33]来测定目标核酸分子的浓度。dd PCR中的病毒核酸分子被稀释成单个分子进行独立平行PCR扩增，扩增后对各PCR反应的荧光信号进行分析，从而达到对核酸分子进行绝对定量的目的。dd PCR中核酸分子单独反应，避免了交叉污染，使其结果更加准确、特异。该方法用于检测流感病毒已经得到了较好的证实[34,35,36]，有研究开发了一种六重dd PCR，可在单一反应混合物中检测甲型流感（H1、H3和M）和乙型流感（Yamagata HA、Victoria HA和M）片段[37]。有研究已经证明，与RT-PCR相比，dd RT-PCR可以更敏感更可靠的估计甲型H7N9流感病毒载量[38]。甲型H1N1流感病毒的一些突变可能改变神经氨酸酶抑制剂奥司他韦的反应，有研究使用dd PCR方法对这些突变进行量化，结果发现dd PCR在量化H1N1病毒耐药菌株方面的灵敏度比q PCR高30倍，准确度比q PCR高10倍[39]。

4、生物传感器检测方法

生物传感器具有操作简单、灵敏度高和反应时间短等优点，这均是得益于电极制造和生物识别元件的设计。生物传感器基于与互补片段的亲和力可以感知DNA、RNA、蛋白质、酶、抗原、抗体等任何生物物体[40]。一个基本的生物传感器包括生物分析物、传感器、放大器和处理器。将样本中的生物成分与已经预先附着在电极表面的受体结合时，以电流、热量和气体的形式产生信号，然后由传感器转换为可读的形式。根据生物传感器所使用的信号读取方式不同可以分为电化学生物传感器、半导体生物传感器、光学生物传感器、压力晶体生物传感器、测热性生物传感器等，其中用于呼吸道病毒检测的电化学生物传感器的研究已是发展最快的科学领域之一，主要包括基于核酸型、免疫型和其他亲和型生物传感器[41]。另一方面，生物传感器在反复使用之后，由于基质效应的存在，其稳定性和准确性会受到影响。此外，生物传感器的灵敏度取决于所使用生物识别元素的特性，如果生物分子浓度较低，常导致检测结果的灵敏度不够高，这就可能会导致产生假阴性或者假阳性的结果。

4.1 基于核酸型生物传感器

以核酸为识别元件的电化学生物感受器一般采用DNA或RNA，其序列通常固定在传感器界面，它通过核酸的特异性序列识别和结合，实现与待测物质发生反应，形成电极信号，信号转换器将其转化为可测量的信号输出。Bhardwaj等[42]通过5轮适配体筛选出了一种针对甲型流感病毒HA蛋白茎区的ss DNA适配体，同时，该适配体可以识别mini-HA蛋白和整个H1N1病毒。基于核酸型生物传感器与基于免疫型传感器相比，核酸体积更小、成本相对低、更稳定、易于生产且免疫原性较低，在开发具有高特异性的新型电化学生物传感器方面具有相当大的潜力[43]。

4.2 基于免疫型传感器

抗体是基于免疫型传感器的生物识别原件，可以识别和结合靶标（抗原）。抗体因具有高特异度、高亲和力和高灵敏度，目前已经成为商业化和实验室生物分析检测的主要选择，并在检测病毒、蛋白质和癌细胞方面显示出了极高的应用价值[44]。由于抗原抗体反应具有特异性，所以免疫型传感器成为检测呼吸道病毒最常用的检测工具之一。抗体可以通过天然或重组、单克隆或多克隆等方法获得，但是其成本相对较高、不稳定、合成复杂，且不适用于小分子、药物和金属离子的检测[45]。

4.3 基于亲和型生物传感器

除核酸、抗体外，还有许多其他类型的生物识别原件，如胎儿蛋白A、多肽和聚糖等。其中胎儿蛋白A可以通过NA蛋白与不同的流感病毒结合，因此可以作为低成本、高选择性的流感病毒检测中的生物识别元件。例如，Anik等[46]开发了一种基于石墨烯-金混合纳米复合材料的电化学生物传感器，用于识别甲型流感。

5、总结与展望

流感的早期诊断有助于及时发现感染病因，可在第一时间内采取有效措施，防止病原传播和阻止疫情扩散。传统的病毒培养方法结果客观、准确，但是耗时长、操作繁琐，对于检测流感病毒来说已经逐渐被淘汰，但是在基础研究方面依然具有一定的意义。免疫学、分子生物学和生物传感器检测由于近年来的快速发展，在灵敏度、准确度和降低成本等方面均进行了优化和改善，其各领域新兴技术不断与POCT技术相结合，特别是与分子生物学和纳米材料等技术的结合，大大缩短了检测时间和检测成本，但真正实现高灵敏度的POCT检测流感病毒仍是医学领域一大挑战。希望在未来检测流感病毒技术领域中，可以实现快速、灵敏、便捷的POCT技术。将众多方法的研究性和实用性真正有效的融为一体，为疾病的预防和控制打下坚实的基础。

参考文献:

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[21]王玺荣,李森,刘继业,等.一种快速检测甲型/乙型流感病毒抗原方法的建立[J].中华预防医学杂志,2023,57(10):1608-1612.

[23]邓涛,吕传硕,刘京,等.流感疫苗神经氨酸酶含量双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立及应用[J].中国生物制品学杂志,2022,35(4):440-447.

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基金资助:浙江省自然科学基金项目(LGF20H200009);浙江省医药卫生科技规划项目(2019331539);杭州市医药卫生科技规划项目(OO20190415);

文章来源:成军,王宁宁,刘梦如等.流行性感冒病毒感染的实验室诊断技术应用进展[J].浙江医学,2024,46(03):240-245.