新型冠状病毒核酸检测的质量控制是指为达到核酸检测结果的准确与可信，在整个操作全过程的每个环节(检测前、检测中和检测后)所进行的一系列符合专业操作的作业过程和管理过程的控制措施，其基础是过程控制，关键是使所有质量过程和活动始终处于完全受控状态[1]。本文通过查阅新型冠状病毒感染(COVID-19)的相关防控方案[2]和重要文献，结合南京市秦淮区疾病预防控制中心实验室新型冠状病毒核酸检测的质量控制措施，总结实验室质量控制体系和现有检测结果，以期评价和完善目前质量控制体系，更有助于COVID-19疫情的监测与防控。

1、材料与方法

1.1样本

实验室日常检测样本来源于南京市秦淮区人员日常保障工作和检测中心复核样本，包含鼻咽、口咽和肛拭子[3,4]。

1.2试剂与仪器

灭活型病毒保存管购自南京仁诺医学检验有限公司(生产批号：V01221101)。核酸提取/纯化试剂购自西安天隆科技有限公司(生产批号：H5108024)、重庆中元汇吉生物技术有限公司(生产批号：22041810T332);扩增试剂购自上海伯杰医疗科技股份有限公司(试剂A,生产批号：20220401X)、广州达安基因股份有限公司(试剂B,生产批号：2022080)、江苏硕世生物科技股份有限公司(试剂C,生产批号：20220518)的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR,fluorescent PCR)。使用仪器包括Tecan Freedom EVO全自动工作站、西安天隆GeneRotex96通道核酸提取仪和罗氏LightCycler 480 II实时荧光定量PCR仪。

1.3质控品

新型冠状病毒核糖核酸非定值质控品购自郑州标源生物科技有限公司(弱阳性，生产批号：20210818)。

1.4方法

1.4.1检测方法

遵守实时荧光定量PCR(real-time fluorescence qPCR)检测规程，使用核酸提取仪对样品和质控品进行RNA提取，采用新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(fluorescence PCR)法进行扩增。将上述提取好的标本核酸、提取好的阴性对照、阳性对照各加入到PCR反应体系中，振荡离心后上机检测。

1.4.2质控措施与方法

①室内质控。本中心选取2022年1月—2022年10月同一批次的质控品为分析对象，分别计算循环阈值(Ct值)的标准差、平均数、上限值和下限值，若超出检测值基线范围，则为失控线性。若在检测值基线范围内，则无失控现象。②环境监测质控。中心参考《农贸(集贸)市场新型冠状病毒环境监测技术规范》中的方法进行拭子涂抹采集，实验室每星期定期进行环境监测(空气、生物安全柜的操作台面、实验室门把手和冰箱门等),进行新型冠状病毒核酸检测。③检测人员比对质控。根据实验室人员的工作年限划分，分成工作年限>5年和工作年限≤5年，在相同实验环境下对阴性和阳性样本进行新型冠状病毒核酸检测，比较两组人员Ct值的CV。④试剂验证质控。对检测试剂进行试剂验证，从最低检测限、阴性阳性符合率、精密度检测评估不同品牌和同一品牌新型冠状病毒核酸检测试剂的质量。⑤核酸试剂检测性能对比。将不同的新冠核酸检测试剂在PCR仪上进行扩增，比较各组Ct值的差异。

1.5结果判读

在核酸检测试剂盒自带阴性和阳性质控结果均在控的情况下，参考核酸检测试剂盒说明书和《新型冠状病毒肺炎防控方案》对结果进行判读。

1.6统计学方法

采用SPSS 22.0对数据进行录入和分析，两组对比用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。检验水准α=0.05。

2、结 果

2.1室内质控结果

对实验室质控品使用试剂A和B分别进行新型冠状病毒real-time fluorescence qPCR检测，试剂A检测结果显示，N基因CV为4.58%,各有1个分别超出上限值(N:33.85)和下限值(N:30.89),ORF 1ab基因CV为5.70%,没有超出上限值(ORF 1ab: 34.78)和下限值(ORF 1ab: 31.02)。试剂B的检测结果显示，N基因CV为3.95%,各有1个分别超出上限值(N:31.96)和下限值范围(N:29.52),ORF 1ab基因CV为6.51%,各有1个分别超出上限值(ORF 1ab: 35.26)和下限值(ORF 1ab: 30.94)。

2.2环境监测结果

2021年3月—2022年10月实验室每星期进行1次环境监测，每次共采集6份样本，分别为3份空气环境检测、3份物表涂抹，检测结果均为阴性。

2.3检测人员比对质控结果

采用不同品牌的荧光PCR检测试剂盒(试剂A、试剂B)进行阳性样本的检测，结果显示，工作年限≤5年的检测人员检测靶标N基因CV为2.12%和1.56%,靶标ORF 1ab基因检测CV为5.82%和1.29%。工作年限>5年组检测到N基因CV较大，为8.11%和1.59%,ORF 1ab基因检测CV为3.90%和3.82%。两组人员检测结果差异无统计学意义(t=-0.67,P=0.53;t=-0.31,P=0.77;t=0.52,P=0.62;t=-0.43,P=0.68)。阴性质控结果均为阴性。

2.4试剂性能验证

2.4.1阴阳性符合率

采用试剂A、试剂B和试剂C分别进行阴阳性符合率的验证，选第三方外部质控品重复10次，及实验室已确认的5例阴性样本进行新型冠状病毒核酸检测，结果显示不同品牌的试剂盒的阳性符合率为100%,阴性符合率为100%。

2.4.2最低检出限

选取定值参考品稀释至理论检出限值500copies/ml进行检测(企业参考品定量评估值为1 000copies/ml),阳性样本平均值为500copies/ml,重复5次，ORF 1ab和N基因的检测结果Ct值均≤37,检验结果均为阳性，检出率为100.00%,符合最低检出限要求。见表1。

表1检出限检测结果(Ct值)

2.4.3精密度验证

选取试剂盒阳性对照作为高值，第三方外部质控品稀释200倍作为低值质控，分别重复10次。试剂A、试剂B、试剂C在进高值对照品检测靶点N基因检测结果Ct值的CV分别为1.71%、1.46%、0.34%,靶点ORF 1ab基因检测结果Ct值的CV分别为1.76%、1.01%、0.45%,满足Ct值的精密度CV≤5.00%,结果为合格。见表2。

采用试剂A、试剂B、试剂C在进低值对照品检测靶点N基因检测结果Ct值的CV分别为0.94%、1.93%、0.46%,靶点ORF 1ab基因检测结果Ct值的CV分别为1.24%、1.59%、1.07%,满足Ct值的精密度CV≤5.00%,结果为合格。见表3。

表2新型冠状病毒精密度-高值性能评价检出结果(Ct值)

为平均值；SD为标准差；CV为变异系数。

表3新型冠状病毒精密度-低值性能评价检出结果(Ct值)

为平均值；SD为标准差；CV为变异系数。

2.5核酸试剂检测性能对比

采用不同品牌的新型冠状病毒核酸检测试剂对质控品进行检测，其他要素(仪器、提取试剂等)相同，进行新型冠状病毒核酸检测时，严格按照标准作业程序进行。见表4、表5。

表4试剂A和试剂B靶标Ct值的检测结果(Ct值)

为平均值；SD为标准差；CV为变异系数。

表5试剂A和试剂C靶标Ct值的检测结果(Ct值)

为平均值；SD为标准差；CV为变异系数。

试剂A、试剂B和试剂C对ORF 1ab基因和N基因均能检出阳性；试剂A和试剂B在检测N基因ORF 1ab基因时Ct值差异有统计学意义(t=7.86、3.20,P<0.05),说明试剂B对N基因和ORF 1ab基因在性能上优于试剂A且靶基因Ct值更小。试剂A和试剂C在检测N基因和ORF 1ab基因时Ct值差异无统计学意义(t=0.98、-0.05,P>0.05),说明试剂A和试剂C性能接近。见表6。

表6检测试剂盒靶标Ct值的配对t检验结果(Ct值)

3、讨 论

核酸检测技术是COVID-19疫情期间监测感染和确诊的重要依据，具有高效、高灵敏和特异的显著技术优势，因SARS-CoV-2的高变异性和因采样部位试剂盒而异的检测结果，专业的实验室、专业实验室人员、专门仪器设备和专门试剂盒是必备条件，而全实验流程的质量控制体系的建立和完善则是迫在眉睫，其需要更多的示范、规范和发展。在常态化疫情防控中，标准新型冠状病毒核酸检测质量控制体系的建立至关重要。

目前，SARS-CoV-2核酸检测的国际标准或参考标准物质已建立，体外转录RNA或假病毒作为标准品及质控品是目前公认的两种标准物质，前者可以质量控制和验证分析方法，但不能进行核酸提取过程中的质量评估，后者可以参与检测实验的整个过程[5]。本实验室购买的非定值质控品为假病毒包装的非定值质控品，在随机抽查的2022年1—7月质控结果中，采用试剂A和B进行核酸检测，两家试剂商的靶标N基因Ct值的CV(4.58%,3.95%)均小于靶标ORF 1ab基因Ct值的CV(5.70%,6.51%),提示N基因检测结果相对稳定，ORF 1ab基因结果相对不稳定，可能因为细胞内病毒ORF 1ab基因的拷贝数远高于N基因，靶标ORF 1ab基因扩增灵敏度更高，更容易发生PCR反应[6]。比较两家试剂商的核酸检测结果发现，虽然试剂A的两个靶标基因Ct值的CV均低于试剂B的CV,但是试剂B的ORF 1ab基因却各有1个超过上限和下限值。CV作为评估检测数值变异程度的一个指标[7],是衡量是否进行实验室内部质控的关键指标，查阅各项专家共识和方案显示，目前针对SARS-CoV-2的实验室核酸检测质量控制的CV并未规定阈值标准，蒯文和等[8]指出参考新型冠状病毒的生物学特点，建议可参考HIV抗体的内部质控标准为20.00%[9],但该质控指标的建立和确认仍需要更多的研究证明。

有研究表明，环境样本(冷冻食品外包装、门把手和运输储藏工具)[10,11]可附着新型冠状病毒，主要是因为SARS-CoV-2可以以气溶胶的形式长期存在于物体表面和空气中。因此，实验室内环境监测也是日常监测体系中的重要措施[12]。

实验人员检测结果比对也是实验室质量控制体系中的重要一环，ISO15189《医学实验室质量和能力认可准则》明确要求PCR实验室每年至少进行1次实验室人员的检测结果比对。研究显示，实验室人员间检测结果的变异系数应≤7.5%,本研究进行了不同工作年限的实验人员的核酸检测结果比对，工作年限>5年的实验人员存在靶基因检测中CV>7.5%,建议实验室应定期开展人员培训，且经考核合格后再开始工作[13]。

COVID-19疫情期间，用于检测SARS-CoV-2的核酸检测试剂盒存在可更快获得研发和审批，一方面促进各商家有力竞争，另一方面却因无法得到大规模的临床验证于评估，从而出现不同商家的试剂盒的质量和性能参数存在缺陷[14],高小玲等[15]总结了目前市面上7种获批的核酸检测试剂盒，其中报道的试剂C和试剂B是本中心所使用的试剂，结果显示单一试剂盒存在检测的靶标基因、灵敏度、特异度和稳定性不均衡的现象[16],因而建议医疗机构至少采用2种以上的不同试剂盒和不同方法复查。本中心主要采用了试剂A与试剂C或试剂B荧光PCR的核酸检测试剂盒进行联合检测。用标准品对实验检测试剂盒进行验证[17,18],本中心所使用的3种试剂盒在阴阳性符合率、最低检出限和精密度的性能验证中均通过。

本研究发现试剂A在靶标N和ORF 1ab基因的Ct值检测显著高于试剂B试剂盒的检测结果，差异有统计学意义(t=7.86、3.20,P<0.05),而与试剂C的两个靶标基因的检测结果并无差异，结合室内质控中试剂A的CV较低，提示试剂A试剂盒可能具备相对较高的敏感和稳定性[19],但也未能开展同种品牌的不同批次的试剂比较，需在后续的控制措施中继续完善。

综上，本研究总结了SARS-CoV-2实验室质量控制体系中的关键控制点[20],良好的试剂盒性能为检测结果提供保障，在全过程开展环境质控室间质控、试剂验证、专业人员比对等措施，是保证核酸检测结果可靠和准确的必要措施。

利益冲突无

参考文献:

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基金资助:江苏省卫生健康委员会科研项目(H2019018);

文章来源:侯海燕,接瑞,董静刚,等.新型冠状病毒核酸检测中实验室质量控制措施分析[J].医学动物防制,2024,40(06):549-553.