棘球蚴病(echinococcosis)是由棘球绦虫的中绦期幼虫引起的一种严重危害人体健康以及畜牧业发展的人兽共患寄生虫病。对人类致病的棘球绦虫主要是细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)和多房棘球绦虫(E.multilocularis)[1]。我国是棘球蚴病最严重的国家之一，主要在西藏、四川、青海、宁夏、甘肃、新疆等地区流行。目前人棘球蚴病的治疗方法主要采取手术切除和药物辅助治疗，但手术治疗风险大，易复发，而药物治疗效果不佳[2]。采取疫苗接种阻断传播途径是较理想途径，但因棘球绦虫生活史复杂，中间宿主种类繁多，目前仍未研制出能对终末宿主(犬类)和中间宿主(牛、羊、人等)具有完全免疫原性的高效疫苗[3-4],因此棘球蚴病的防治仍面临巨大挑战。研发新型疫苗候选分子及诊断和药物靶标对于有效控制棘球绦虫感染及提高包虫病诊疗效果具有重要意义。

钙蛋白酶(Calpain)是一种主要存在于细胞质中的半胱氨酸蛋白酶[5],被钙离子激活后可以对多种蛋白质底物进行水解进而调节蛋白质的活性[6],与细胞增殖、细胞凋亡和分化等过程有关[7]。Siddiqui等[8-9]的研究表明，钙蛋白酶与血吸虫逃避宿主免疫反应有关，用血吸虫钙蛋白酶免疫小鼠，可诱导宿主产生Th1型免疫应答，并且与人和其他脊椎动物钙蛋白酶不会产生交叉免疫反应，因此钙蛋白酶可以作为血吸虫病的候选疫苗靶点之一。Zhang等[10-11]对钙蛋白酶的表位进行分析，表明钙蛋白酶可能作为血吸虫病的免疫诊断靶标。此外，Gomes等[12]发现利用钙蛋白酶特异抑制剂可以降低恶性疟原虫钙蛋白酶的表达，降低恶性疟原虫的存活率，证明钙蛋白酶可能是潜在抗疟靶点，可用于挖掘疟疾新型药物。王芬等[13]对细粒棘球蚴Calpain蛋白进行生物信息学分析，为研制基于Calpain的棘球蚴病疫苗提供了理论基础。寄生虫来源的钙蛋白酶可能作为疾病的免疫诊断靶标以及疫苗的靶点已有研究，但目前关于多房棘球绦虫钙蛋白酶(Em-Calpain A)的生物学功能研究尚鲜有报道。

本研究对Em-Calpain A基因进行分子克隆和体外诱导表达，并免疫新西兰大白兔制备抗Calpain A多克隆抗体，以期为后续Em-Calpain A生物学功能鉴定及其在棘球绦虫生长发育和致病性相关研究提供研究基础和参考。

1、材料与方法

1材料

1.1虫体、质粒及菌株

原头蚴和pET28a载体由本室保存；大肠埃希菌(Escherichia coli)感受态细胞Top10和BL21(DE3)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2主要试剂

总RNA快速提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、高敏型ELC化学发光检测试剂盒均购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；BamHI和XhoI限制性内切酶购自美国NEB公司；TMB显色液购于美国Promega公司；HRP标记的山羊抗兔IgG购于生工生物工程股份有限公司；HRP标记的抗His标签抗体(anti-His-HRP)购于美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3实验动物

健康新西兰大白兔，3只，雌性，由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SCXK(甘)2020-0010。

2方法

2.1 Em-Calpain A基因序列特征分析

从Wormbase数据库(Version: WBPS19)以及NCBI蛋白数据库中下载多房棘球绦虫Em-calpain A基因序列(EmuJ_000911200)、细粒棘球绦虫、亚洲带绦虫、牛带绦虫、肝片吸虫、日本血吸虫、恶性疟原虫以及人、犬、牛的钙蛋白酶蛋白氨基酸序列。采用在线分析工具对基因结构、氨基酸同源性、蛋白理化性质、功能结构域等进行预测和分析(表1)。选择与Em-Calpain A蛋白氨基酸序列同源性最高且>40%的模型作为同源建模的模板，利用分子模拟系统(Discovery studio 2018)预测Em-Calpain A的三级结构。通过MEGA7.0软件中的邻接法构建Em-calpain A和其他物种的系统进化树，bootstrap设为2000。

表1在线软件

2.2引物的设计与合成

参照Em-calpain A核苷酸序列(Wormbase: EmuJ_000911200),利用SnapGene软件设计编码基因带有同源臂的特异性上、下游引物及菌液鉴定引物T7-F和T7-R(表2),均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表2引物序列

2.3 Em-Calpain A基因的克隆与原核表达载体构建

参照总RNA快速提取试剂盒说明书提取原头蚴总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板PCR扩增Calpain A基因。PCR体系：1μL cDNA,上、下游引物各1μL,2×pfu PCR Mix 25μL,22μL ddH2O。扩增程序：95℃预变性5 min; 95℃变性15 s, 55℃退火90 s, 72℃延伸60 s,共25个循环；72℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证。使用内切酶BamHI和XhoI对pET28a载体进行酶切后，与回收的Calpain A基因片段利用T4连接酶16℃连接过夜，将连接产物转化至E.coliTOP10感受态细胞，挑取单个菌落接种至LB培养基培养。经酶切鉴定，阳性克隆菌液送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序验证。

2.4 Em-Calpain A重组蛋白的表达、纯化及鉴定

将重组质粒转化至E.coliBL21(DE3)中，涂至含终浓度50μg/mL卡那霉素(kan+)的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱培养，挑取单个菌落加入LB液体培养基(kan+)中，37℃摇菌培养至对数生长期后加终浓度0.5 mmol/L的IPTG诱导表达，诱导8 h后收集菌液并进行超声破碎，离心后分别收集上清及包涵体，采用10% SDS-PAGE电泳分析。切下目的条带进行蛋白胶回收[14],并使用丙酮沉淀蛋白后用PBS复溶，重组蛋白转移至PVDF膜上，使用5%脱脂牛奶封闭2 h,洗涤；加入1∶2000稀释的anti-His-HRP抗体，37℃孵育1 h;洗涤3次后滴加ECL化学显色液曝光。

2.5多克隆抗体的制备及效价测定

随机选取3只新西兰大白兔，注射前采集兔阴性血清。采用纯化后的Em-Calpain A蛋白皮下多点注射免疫实验兔，共免疫4次，首次注射时采用蛋白+弗氏完全佐剂，21 d后用蛋白+弗氏不完全佐剂进行加强免疫，末次免疫后第10 d心脏采血制备血清。采用ELISA检测抗体效价，以1∶32～1∶1 048 576倍比稀释的多抗血清和兔阴性血清为一抗，1∶2 000稀释的山羊抗兔IgG-HRP作为二抗，反应完成后用酶标仪检测450 nm处吸光值，分析多克隆抗体效价。

2.6多抗血清的Western blot分析

采用液氮研磨和裂解法提取原头蚴总蛋白[15]。将原头蚴蛋白和His-Em-Calpain A蛋白进行SDS-PAGE后，使用转膜仪转移至PVDF膜上。使用5%脱脂牛奶封闭2 h,洗涤；分别以1∶200稀释的多抗血清和兔阴性血清作为一抗，4℃孵育过夜，洗涤5次；以1∶2 000稀释的山羊抗兔IgG-HRP作为二抗，37℃孵育1 h,洗涤3次后滴加ECL化学显色液曝光。

2、结 果

1 Em-Calpain A基因的生物信息学分析

1.1 Em-Calpain A理化性质、信号肽及跨膜结构域

Em-Calpain A基因CDS大小为2 469 bp,编码822个氨基酸，其中主要氨基酸为亮氨酸(Leu, 8.5%)、甘氨酸(Gly, 8.3%)、丝氨酸(Ser, 7.8%)和天冬氨酸(Asp, 7.1%);分子质量为92.13 ku,分子式为C4091H6324N1126O1233S35;理论等电点为5.30;不稳定系数为42.01,脂溶指数和总平均疏水指数分别为76.40和-0.344,表明Em-Calpain A蛋白可能为亲水蛋白，稳定性低。此外，Em-Calpain A无信号肽、不含跨膜结构域。

1.2 Em-Calpain A蛋白结构域

Em-Calpain A蛋白含有1个钙蛋白酶样硫醇蛋白酶结构域(CysPc)、1个钙蛋白酶III结构域(Calpain III)、1个低度重复序列区域(lowcomplexity)、2个E、F的螺旋-环-螺旋结构(EF-hand),分别位于98-420 aa、426-575 aa、642-657 aa、704-732 aa和734-762 aa(图1)。

1.3 Em-Calpain A蛋白二级结构

Em-Calpain A蛋白二级结构中含有α螺旋、延伸链、无规则卷曲和β转角，占比分别为30.54%、18.61%、44.77%和6.08%(图2)。

图1 Em-Calpain A蛋白结构域预测

图2 Em-Calpain A蛋白二级结构预测

1.4 Em-Calpain A蛋白三级结构

Blast搜索PDB-nr95数据库结果表明，人m-Calpain A蛋白(PDB:1KFU_L)与Em-Calpain A序列同源性最高，为41.0%,与Em-Calpain A序列的叠合长度为719,可作为Em-Calpain A同源建模的模板。利用Discovery Studio构建的3D结构显示，Em-Calpain A的三级结构主要有α螺旋以及无规则卷曲，且Em-Calpain A较模板多一个loop环(图3A-C)。从Ramachandran Plot显示预测模型拉氏评分为92.1%(图3D),表明该模型预测质量较好。

图3 Em-Calpain A蛋白三级结构预测

2 Em-Calpain A同源性分析

将Em-Calpain A与其他物种氨基酸序列进行多重比对，通过MEGA 7.0软件对不同物种来源的Calpain A蛋白构建进化树(图4)。Em-Calpain A序列与带科绦虫聚于一类，与细粒棘球绦虫、亚洲带绦虫和牛带绦虫亲缘关系较近，核苷酸序列的同源性分别为98.7%、88.4%和86.8%,氨基酸序列的一致性分别为99%、88.1%和85.5%;与肝片吸虫、日本血吸虫、人、犬、牛及原虫亲缘关系较远，核苷酸序列的同源性低于52.0%,氨基酸序列的一致性低于45.0%。

图4 Em-Calpain A蛋白进化树分析

3 Em-Calpain A基因克隆与原核表达载体构建

PCR扩增出约2 469 bp的目的条带，与预期目的条带大小一致(图5A)。pET28a-Em-Calpain A重组质粒经XhoI单酶切后出现约1 450 bp条带，符合实验预期结果(图5B),说明pET28a-Em-Calpain A原核表达载体构建成功。

图5 Em-Calpain A基因凝胶电泳结果

4 pET28a-Em-Calpain A蛋白的诱导表达及纯化

pET28a-Em-Calpain A/BL21菌液经0.5 mmol/L IPTG诱导后成功表达目的蛋白His-Em-Calpain A;目的蛋白主要存在于菌体裂解沉淀中，以包涵体形式表达；切胶回收的目的蛋白为单一条带，大小约93 ku,均与预测分子质量基本一致(图6A)。Western blot分析结果显示，纯化后的His-Em-Calpain A可被His标签抗体识别，在约93 ku处有明显条带(图6B),His-Em-Calpain A重组蛋白成功表达和纯化。

图6 Em-Calpain A重组蛋白的10% SDS-PAGE及Western blot分析

5抗体效价的测定

ELISA检测结果表明，1～3号免疫兔血清自1∶32开始倍比稀释至1∶1048576进行抗体检测，以P/N>2.1判定为阳性值，血清效价均达1∶262144(图7)。

图7兔血清抗体效价的ELISA测定

6多抗血清的Western blot分析

Western blot分析免疫兔阳性血清可特异性识别重组蛋白和天然蛋白，均在约93 ku左右处出现反应条带，阴性血清则无反应(图8)。

图8多抗血清的Westernblot分析

M蛋白质分子质量标准1、3重组蛋白2、4天然蛋白

3、讨 论

钙蛋白酶是一类具有重要生物学功能的蛋白酶，寄生虫中的许多钙蛋白酶对生物体的致病性和活力发挥重要作用；靶向这些钙蛋白酶是对抗疾病的一种有效方法[16],研究表明钙蛋白酶可作为疟疾[17]、锥虫病[18]、血吸虫病[19]等疾病的潜在治疗靶点。经典的钙蛋白酶结构包括位于N端的α螺旋结构(结构域I)、CysPc结构(结构域II)、C2结构(结构域III)和EF-hand结构(结构域IV)。结构域I及结构域III调节钙蛋白酶活性；结构域II为催化活性中心，是钙蛋白酶的水解活性的关键部位；结构域IV是钙离子的结合部位。非经典的钙蛋白酶无C2结构(结构域III)和EF-hand结构(结构域IV)[20]。本研究对多房棘球绦虫钙蛋白酶进行了生物信息学分析，发现Em-Calpain A存在典型的C2结构域及EF-hand结构，属于经典钙蛋白酶。EF-hand结构域是一种螺旋-中央环-螺旋的结构，具有钙结合位点，EF-hand结构对日本血吸虫病及细粒棘球蚴病有潜在的诊断价值[21-22]。基于人m-Calpain A(1KFU_L)蛋白构建Em-Calpain A蛋白三级结构模型，使用Ramachandran Plot验证模型质量[23],拉氏评分表明预测模型质量较好，从模板1KFU_L与Em-Calpain A三级结构拟合图可以看到多房棘球蚴Calpain A较模板多一个由无规则卷曲形成的loop环，由于loop环无规则结构，因此具有较高的灵活性和可塑性，可能在蛋白的构象和功能活性中发挥重要作用。

原核表达系统因缺乏一些蛋白质折叠所需的辅助因子，无法对表达的蛋白进行适当的修饰和折叠，因此蛋白多以不可溶的包涵体方式表达[24]。目前主要采用镍(Ni)亲和层析法对带His标签的包涵体蛋白进行纯化；但本研究在重组蛋白前期纯化时发现，采用0.2%、1%、2%的脱氧胆酸钠(DOC)洗涤包涵体，用温和型变性剂十二烷基肌氨酸钠(SKL)进行变性溶解，或者采用强变性剂4～8 mol/L尿素进行变性溶解3 h,均不能有效溶解His-Em-Calpain A包涵体，对后续亲和层析纯化蛋白造成了困难。研究表明SDS-PAGE电泳已成为分离和制备蛋白质的有效方法，从凝胶中回收的蛋白可成功用于制备抗体或蛋白测序等[14]。本研究采用切胶洗脱回收His-Em-Calpain A包涵体蛋白，再将蛋白用丙酮沉淀处理，获得了高纯度重组蛋白；以其免疫新西兰大白兔获得了高效价多克隆抗体，可特异识别His-Em-Calpain A和原头蚴的Calpain A天然蛋白；说明切胶回收蛋白方法简单可行，纯化的目的蛋白具有良好的免疫原性和反应性，适用于后续蛋白功能的研究。此外，切胶回收蛋白较Ni亲和纯化法操作简便，避免了尿素对实验的干扰；结合丙酮沉淀后可得到较高纯度的蛋白并可以保护蛋白质的结构和活性，而且成本较低、作用时间短、回收率高，应用范围更广，适用于绝大多数蛋白质的纯化[25]。

综上所述，本研究对多房棘球蚴Calpain A蛋白进行了生物信息学分析、基因克隆和表达纯化；使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备了Calpain A多克隆抗体，多抗效价达1∶262 144,并且制备的多抗可与重组蛋白和天然蛋白反应，为进一步探讨多房棘球蚴Calpain A的生物学功能提供了理论参考。

参考文献:

[4]于涛,王利磊,赵慧卿,等.细粒棘球蚴病疫苗的研制现状[J].中国病原生物学杂志,2024,19(1):107-112.

[13]王芬,陈林,赵明才,等.细粒棘球绦虫Calpain蛋白的生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志,2019,14(10):1171-1177.

[14]康彬童哲.一种利于蛋白质回收的快速SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色-脱色方法[J].生物化学与生物物理进展,2000,5(2):210-211.

[15]李红,李艳萍,刘婷丽,等.多房棘球蚴感染对小鼠肝脂质代谢的影响[J].畜牧兽医学报,2023,54(1):263-271.

基金资助:国家重点研发计划项目(No.2022YFD1302102-06);国家自然科学基金项目(No.31772726);青海大学医学部中青年科技项目(No.2023-kyy-2);

文章来源:李慧敏,张少华,张月玥,等.多房棘球蚴Calpain A基因克隆､表达及其多克隆抗体制备[J].中国病原生物学杂志,2025,20(01):8-13.