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贝塞尔双光子光片显微镜在活体生物成像中的应用

2024-11-14 175 上传者：管理员

摘要：双光子光片显微镜具有分辨率高、光漂白低等优势，在生物学领域有着广泛的应用。但由于照明光片厚度与长度之间的取舍矛盾问题，导致轴向分辨率和成像视场无法兼顾，因此在应用中受到限制。为了解决这一问题，本文采用液晶空间光调制器将普通高斯照明光束调制为贝塞尔光束，利用贝塞尔光束的“无衍射”特性实现了大且薄的光片照明，光片长度与厚度之比达到了163。在此基础上，设计并搭建了一套贝塞尔双光子光片显微镜，在310μm的视场范围内实现了横向440 nm、轴向1.9μm的三维高分辨率成像。本文成功实现了斑马鱼胚胎的活体成像，可以做到血液细胞流速的测量和脊柱骨细胞的分割计数，验证了贝塞尔双光子光片显微镜在活体生物成像中的应用潜力。

关键词：
双光子光片显微镜
活体成像
液晶空间光调制器
生物荧光显微镜
贝塞尔光束
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1、引言

生物荧光显微镜使用特定波长的激发光照射生物组织中的特定对象，使其标记的荧光物质发射荧光，进行结构性和功能性成像，已经成为生命科学研究的重要工具。在众多的荧光显微镜中，双光子光片显微镜[1]采用双光子显微镜的激发方式[2]和光片显微镜的照明方式[3]，具有以下优势：（1）低光毒性和光漂白效应。照明光路和成像光路相互垂直的光片照明方式使得只有成像物镜焦平面上的生物组织才会被照亮，有效减少了非焦平面处生物组织的无效曝光，显著降低了光毒性和光漂白效应。（2）高分辨率和对比度。双光子激发概率正比于照明光强的平方[4]，因此只有照明焦点处才会产生双光子荧光现象，这使得双光子光片显微镜具有较高的空间分辨率和对比度。（3）低光损伤和高成像深度。照明光使用近红外波段，减小了生物组织的吸收和散射，降低了对活体细胞和组织的光损伤，提高了成像深度[5]。同时许多荧光探针的双光子激发光谱要比单光子激发光谱更宽[6]，因此可以利用同一激光器同时激励不同荧光探针，获得生物样品内不同的信息，从而实现多标记复合测量。双光子光片显微镜的上述优势使它在脑神经成像[7]、病理学[8]、器官活动监测[9]等领域具有众多应用。

双光子光片显微镜利用光片照明选择性地照亮样品中的薄平面，从而实现对观测样品的“光学层切”。一般来说，光片的厚度远小于检测物镜的景深，导致轴向（层切）分辨率取决于光片厚度；而成像视场则取决于光片大小。因此实现大视场、高分辨率成像的关键在于获得一个大而且薄的照明光片。照明光片在Z方向（层切方向）上的厚度主要由照明物镜的数值孔径决定，采用大数值孔径的照明物镜即可获得较薄的照明光片。在X方向（振镜扫描方向）上的宽度由照明物镜放大倍率和扫描振镜的扫描角度决定，而目前扫描振镜的扫描角度一般都能达到数十度，因此X方向上的宽度并不构成限制。然而对于通常的高斯照明光束来说，在Y方向（照明光轴方向）上只有在焦点附近的光片才能维持较薄的厚度，随着偏离焦点，厚度会急剧变大。通常Y方向的长度与Z方向的厚度之比都小于10，导致维持较薄厚度的光片长度很小。也就是说，获得大且薄的照明光片的限制在于如何扩大Y方向上的长度。

2015年，北京大学的陈良怡研究组利用超高速可调声学梯度（Tunable Acoustic Gradient,TAG）透镜使得照明光焦点在照明光轴方向（Y方向）上快速扫描来扩大照明光片的长度，在170μm视场范围内的横向分辨率和轴向分辨率分别达到了420 nm和800 nm[10]。但由于进出口管制，现在国内很难买到TAG透镜。2020年，UT Southwestern Medical Center的Reto Fiolka在双光子光片显微镜的照明光路额外引入一个扫描振镜、物镜以及反射镜，同样实现了照明光焦点在照明光轴方向上的快速扫描，从而扩大了照明光片的长度，在55μm视场范围内的横向分辨率和轴向分辨率分别达到了410 nm和2.07μm[11]。但这种方法极大地增加了照明光路的复杂度，同时最终实现的视场也有限。

另一个思路是将照明光束由高斯光束调制为贝塞尔光束，利用贝塞尔光束的“无衍射”特性扩大照明光片的长度。不同于高斯光束，贝塞尔光束可以维持光斑形貌不变而传播相当长的距离[12]，因此非常适合作为双光子光片显微镜的照明光束。基于液晶空间光调制器实现贝塞尔光束调制，我们设计了一套贝塞尔双光子光片显微镜，给出了详细的光学结构设计，利用荧光微珠成像实验检验了显微镜的性能参数，并利用斑马鱼胚胎验证了活体成像能力。

2、贝塞尔双光子光片显微镜的设计及工作原理

我们设计的贝塞尔双光子光片显微镜具有如图1所示的光学结构，整个光路可以分为两个相互垂直的光路：（1）照明光路由近红外飞秒激光（Laser）、扩束器（BE）、液晶空间光调制器（SLM）、反射镜M1与M2、透镜L1～L3、扫描振镜（GS）以及照明物镜（IO）组成；（2）成像光路由成像物镜（DO）、低通滤光片（Filter）、成像透镜L4以及成像相机（Camera）组成。

图1贝塞尔双光子光片显微镜的光学结构

液晶空间光调制器（SLM）的作用是将入射的高斯光束调制为贝塞尔光束，再经过L1与L2、L3与IO两组4F透镜系统的传导，在样品（Sample）中同样形成贝塞尔光束照明。贝塞尔光束的调制是通过在SLM上施加轴棱锥相位ΦB来实现的：

其中：（x,y）是SLM的像素位置；ΦB具有同心圆环的结构形式，如图1所示；可变参数r0是圆环的宽度（一个圆环范围内相位从0变化到2π），它决定了贝塞尔光束的长度和厚度。图2(a）展示了轴棱锥相位调制贝塞尔光束的基本原理：入射的高斯光束被轴棱锥相位折射，所有的光线都以一定的偏转角度β朝向光轴偏转，围绕光轴形成的多个平面波的干涉会产生贝塞尔光束。产生的贝塞尔光束在长度L的范围内会维持基本形貌不变，如图2(b）所示。在Y方向上不同位置的贝塞尔光束在X-Z平面内的截面图如图2(c）所示。可以看出，贝塞尔光束除了中心主光束外，在主光束周围还存在一些环状的旁瓣，这在贝塞尔光束做单光子激发时会对轴向分辨率有一定影响。但由于双光子激发概率正比于照明光强的平方，而旁瓣的强度远低于主光束，因此在做双光子激发时，旁瓣将无法激发出双光子荧光，只有主光束能够激发出一条长且细的“针状”双光子荧光。贝塞尔光束的长度与厚度之比可以做到数百乃至上千，因此可以实现数百微米范围内厚度为微米级的大视场薄光片照明。

图2轴棱锥相位调制贝塞尔光束基本原理

贝塞尔照明光片仅照亮样品X-Y方向上的一个平面，样品在该平面内的荧光分子或原子同时（小于0.5 fs）吸收两个照明光子而成激发态，通过弛豫过程，辐射出一个波长略大于1/2照明光波长的荧光光子[13]。激发的荧光光子被焦面与照明光片平面重合的成像物镜收集，经低通滤光片后通过成像透镜在成像相机上成像。由于激发的荧光波长远小于照明光波长，因此利用低通滤光片可以有效地滤除散射的照明光对成像的影响。这样，贝塞尔双光子光片显微镜单次可以实现样品X-Y平面内的一个“层切”成像。这个层切是通过照明光片实现的“光层切”，不会破坏样品的物理结构，因此可以实现活体生物的层切成像。然后通过电控平移台带动样品在Z方向上平移，就可以实现样品的三维层切成像。

3、结果与讨论

根据图1所示的光学设计，我们搭建了一套贝塞尔双光子光片显微镜。具体的元器件参数如下：照明激光为Spak Lasers公司的ALCOR 920-2飞秒激光器，激光波长为920 nm，脉冲宽度为100 fs，重复频率为80 MHz。SLM为Meadowlark Optics公司的HSP512L液晶空间光调制器，像素数为512×512。BE是Tharlabs公司的BE02-05-B扩束器。透镜L1～L4的焦距分别为200、80、180、200 mm。GS为Thorlabs公司的GVS011振镜，最大扫描角度为±20°。照明和成像物镜（IO和DO）均为Nikon公司的N40X-NIR物镜，有效焦距为5 mm，放大倍率为40，数值孔径为0.8。Filter为Thorlabs公司的FESH0700低通滤光片，截止波长为700 nm。Camera为Andor公司的Zyla4.0 s CMOS相机，像素数为2 048×2 048，像素尺寸为6.5μm。完成贝塞尔双光子光片显微镜的搭建后，在罗丹明6G溶液中验证了贝塞尔双光子荧光的激发，如图3所示。图3(a）、（b）分别是贝塞尔和高斯照明光束激发的双光子荧光，图3(c）、（d）分别是贝塞尔和高斯双光子荧光截面的光强分布。贝塞尔双光子荧光长度达到了310μm，厚度为1.90μm，长度与厚度之比达到了163；而高斯双光子荧光厚度虽然能达到0.74μm，但长度仅为3.1μm，长度与厚度之比仅为4.2。实验证实贝塞尔光束确实可以作为双光子光片显微镜的照明光束来扩大照明光片的大小。

为了检验贝塞尔双光子光片显微镜的性能，对溶于琼脂柱中的直径100 nm的荧光微珠（Thermo Fisher公司，型号F8803）进行了成像，结果如图4所示。由图4(a）可见，在整个视场范围内微珠形貌、亮度都比较均匀。为了测量显微镜的横向分辨率，图4(b）、（c）分别给出了单个微珠在X及Y方向上的成像灰度分布（黑线：原始数据；蓝线：高斯拟合曲线）。测量高斯拟合曲线的半高全宽（FWHM），可以测到在X和Y方向上的横向分辨率分别为442和440 nm。进一步为了测量轴向分辨率，利用电控平移台（Thorlabs公司，型号MT3/M-Z9）带动样品在Z方向上以300 nm的步长平移，相当于以0.3μm的精度对微珠进行层切成像，得到单个微珠在Z方向上的灰度分布，如图4(d）所示（黑线：原始数据；蓝线：高斯拟合曲线）。测量高斯拟合曲线的半高全宽（FWHM），可以得到Z方向上的轴向分辨率为1.88μm，与在罗丹明6G溶液中直接测量贝塞尔光束的厚度相当。

图3罗丹明6G溶液中激发的光束及光强分布曲线。（a）贝塞尔光束（标尺：50μm);(b）高斯光束（标尺：5μm);(c）贝塞尔光束的截面光强分布曲线；（d）高斯光束的截面光强分布曲线。

为了验证贝塞尔双光子光片显微镜对活体生物样品的成像能力，对吖啶橙染色的发育5天的斑马鱼胚胎进行了成像，如图5所示。我们对斑马鱼胚胎的同一位置进行了多帧成像（总帧数为200帧，单帧曝光时间为300 ms），将所有图像合成视频后发现，红框部分有椭圆状细胞呈单方向的、近乎匀速的流动状态，因此判定斑马鱼胚胎处于活体状态，此处为血液细胞在流动。图5右图给出了左图红框部分在其中5帧的局部放大图，可以看到不同帧间仅血液细胞发生了变化，其他结构没有变化。进一步，通过对视频中单个血液细胞的追踪，发现它的位置在300 ms内约移动了6.78μm，因此可以计算出该处血液的流动速度大约为22.6μm/s。

图4荧光微珠成像结果及光强分布曲线。（a）荧光微珠成像结果（标尺：50μm);(b）单个微珠在X方向上的灰度分布；（c）单个微珠在Y方向上的灰度分布；（d）单个微珠在Z方向上的灰度分布。

图5活体斑马鱼胚胎的成像结果（标尺：50μm)

图6是活体斑马鱼胚胎尾部的成像结果，从图中可以清楚地看到长条状的肌肉细胞。同时值得注意的是，贝塞尔光束甚至可以穿透斑马鱼胚胎的脊柱，可以看到骨细胞的形貌，从而实现对骨细胞的分割，如图6右侧结果所示。由于双光子光片显微镜的低光毒性和低光漂白性，甚至可以实现活体生物长达数天的长时间成像，这样就可以实现胚胎发育过程中骨细胞数量、密度的实时监测。

图6活体斑马鱼胚胎尾部成像结果（标尺：50μm）。左：成像结果；右：骨细胞分割结果。

4、结论

贝塞尔光束的“无衍射”特性使得它非常适合作为双光子光片显微镜的照明光束。我们利用液晶空间光调制器将高斯光束调制为贝塞尔光束，成功地在双光子光片显微镜中实现了厚度1.9μm、长度310μm的光片照明，成像的横向分辨率达到了约440 nm。在此基础上，成功实现了斑马鱼胚胎的活体层切成像，可以做到血液细胞流速的测量和脊柱骨细胞的分割计数，验证了贝塞尔双光子光片显微镜在活体生物成像中的应用潜力。目前设计的贝塞尔双光子光片显微镜的轴向分辨率仍然差于横向分辨率，下一步的研究工作将聚焦于如何进一步提高轴向分辨率，从而实现大视场三维一致的高分辨率成像。

基金资助:吉林省科技厅发展计划(No.YDZJ202301ZYTS348);吉林省教育厅科学技术研究规划(No.JJKH20220833KJ);长春师范大学自然科学项目(No.CSJJ2022002ZK)~~;

文章来源:卜庆盼,罗芳琳,张杏云.贝塞尔双光子光片显微镜在活体生物成像中的应用[J].液晶与显示,2024,39(11):1477-1482.